侯慧君，張 欣，徐承倩，付旭彬，李建軍，孫英峰*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2. 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 ，天津 300300)

奶牛乳腺炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。據(jù)報(bào)道，該病相關(guān)病原已達(dá)150多種以上，主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及無(wú)乳鏈球菌。目前，奶牛乳房炎的治療主要包括全身及乳房局部的抗感染治療，但全身用藥治療時(shí)乳房局部很難達(dá)到殺菌有效濃度，局部用藥極易引起乳制品中抗生素藥物殘留和超標(biāo)。因此，科學(xué)有效的乳頭藥浴消毒是預(yù)防乳腺炎的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，能夠有效降低乳房炎的發(fā)生率、減少經(jīng)濟(jì)損失、保證原奶品質(zhì)[3]。

目前，奶牛成膜性乳頭藥浴液較多，多數(shù)采用聚乙烯醇(PVA)作為藥浴液成膜基質(zhì)，而世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2017年10月27日公布的致癌物清單，將PVA列在3類致癌物清單中，因此從食品安全角度出發(fā)，迫切需要尋找安全無(wú)毒成膜基質(zhì)替代品。海藻酸鈉(ALG)又稱海藻膠、褐藻酸鈉或海帶膠，是一種天然多糖，廣泛應(yīng)用于食品可食用保鮮劑以及制藥片劑的粘合劑領(lǐng)域。ALG屬于無(wú)毒食品，早在1938年就已被收入美國(guó)藥典，1963年收入英國(guó)藥典，2010年中國(guó)藥典首次收錄海藻酸鈉為藥用輔料，因具有較好的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性等特點(diǎn)，現(xiàn)已經(jīng)被廣泛用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域[4-6]，但尚未見(jiàn)以海藻酸鈉成膜基質(zhì)乳頭藥浴液用于預(yù)防和治療奶牛乳房炎的報(bào)道。本試驗(yàn)考察海藻酸奶牛乳頭藥浴成膜基質(zhì)可行性，并先后進(jìn)行安全性、有效性、保質(zhì)期及臨床有效性試驗(yàn)研究，為奶牛乳腺炎防治獸藥新劑型的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑與設(shè)備

海藻酸鈉粘度(10 g/L，20 ℃)(Pa.s)≥0.02，購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)公司，聚維酮碘溶液、硫代硫酸鈉、瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自天津六合生物技術(shù)公司。超凈臺(tái)(江蘇通凈)、滅菌高壓鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、天平(奧豪斯儀器常州有限公司)、磁力攪拌儀(天津歐諾儀器儀表有限公司)、低速離心機(jī)(上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)、移液槍、離心管。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)家兔，購(gòu)自北京通威實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.4 藥浴液成膜性試驗(yàn)

配制濃度為1%海藻酸鈉溶液，加入穩(wěn)定劑氯化鈣(終濃度0.034 g/100 mL)[7]及護(hù)膚成分甘油(終濃度10%)，加入5 mL聚維酮碘溶液，制得藥浴液。用塑料滴管模擬乳頭，蘸取一定量藥浴液置于通風(fēng)且陽(yáng)光散射處，計(jì)算成膜時(shí)間。

1.5 藥浴液安全性試驗(yàn)

依據(jù)《中國(guó)獸藥典》(2015)開(kāi)展皮膚的刺激性安全試驗(yàn)。選擇9只成年健康母兔進(jìn)行皮膚敏感性試驗(yàn)，連續(xù)7 d，分別將聚維酮碘原液、藥浴液和生理鹽水分別抹于母兔的背部皮膚，進(jìn)行觀察。試驗(yàn)7 d后，切下背部皮膚，制作切片，觀察病理變化。

1.6 藥浴液有效性試驗(yàn)

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》要求，采用殺菌率判定藥浴液有效性。取標(biāo)準(zhǔn)菌種接種于LB肉湯培養(yǎng)基，細(xì)菌計(jì)數(shù)調(diào)整濃度量為1×108～5×108cfu/mL進(jìn)行殺菌率試驗(yàn)。殺菌時(shí)間依次為30 s、5 min，采用硫代硫酸鈉進(jìn)行中和，細(xì)菌計(jì)數(shù)并計(jì)算殺菌率。

1.7 藥浴液保質(zhì)期試驗(yàn)

將制備好的成膜性乳頭藥浴液，在常溫避光條件下保存，按照成膜性試驗(yàn)及有效性步驟，分別設(shè)定30 d、90 d、180 d成膜效果及殺菌率，評(píng)估保質(zhì)期。

1.8 藥浴液對(duì)比試驗(yàn)

購(gòu)買市售某商品化聚乙烯醇(PVA)成膜基質(zhì)的奶牛乳頭藥浴液，查看生產(chǎn)日期，選取日期相近成膜藥浴液測(cè)定5 min時(shí)間節(jié)點(diǎn)殺菌率。

1.9 藥浴液臨床應(yīng)用試驗(yàn)

選取天津武清區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，將本產(chǎn)品用于擠奶后藥浴，觀察成膜效果及牛場(chǎng)臨床乳腺炎發(fā)病情況，并采用LMT法測(cè)定應(yīng)用前后隱性乳腺炎發(fā)病比例，評(píng)估本產(chǎn)品臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié) 果

2.1 藥浴液成膜性結(jié)果

通過(guò)體外模擬成膜性試驗(yàn)可知，本試驗(yàn)研制的藥浴液可以在室溫自然環(huán)境條件情況下，約在5 min可以成單層薄膜，且韌性良好。

2.2 藥浴液安全性結(jié)果

試驗(yàn)第1～2天，聚維酮碘原液組中家兔皮膚部位出現(xiàn)紅色炎性反應(yīng)并出現(xiàn)小疙瘩現(xiàn)象，第3天開(kāi)始消退，海藻酸鈉成膜藥浴液和生理鹽水對(duì)照組均無(wú)不良反應(yīng)。顯微病理切片結(jié)果顯示聚維酮碘原液組皮下血管高度充血，海藻酸鈉成膜性藥浴液組僅表現(xiàn)輕微血管充血，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異，具體見(jiàn)圖1。

圖1 海藻酸鈉成膜性乳頭藥浴液對(duì)家兔皮膚刺激性顯微切片結(jié)果(100×)Fig.1 Results of microscopic sectioning of rabbit skin by sodium alginate film-forming papillary bath (100×)

2.3 藥浴液有效性結(jié)果

本試驗(yàn)研制的成膜性乳頭藥浴液在30 s、5 min的殺菌率詳見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，海藻酸鈉成膜性藥浴劑在30 s對(duì)奶牛乳腺炎常見(jiàn)病原菌殺菌率達(dá)99.99%以上。

表1 海藻酸鈉成膜性藥浴液對(duì)奶牛乳腺炎致病菌的殺菌效果Table 1 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis

2.4 藥浴液保質(zhì)期內(nèi)不同時(shí)間殺菌效果

本試驗(yàn)研制的成膜性乳頭藥浴液在30 d、90 d、180 d時(shí)間，均可在5 min成膜，成膜效果良好，且表現(xiàn)出良好殺菌率(見(jiàn)表2)。

表2 海藻酸鈉成膜性藥浴液對(duì)奶牛乳腺炎致病菌的殺菌效果Table 2 Sterilization effect of sodium alginate film-forming medicated bath on pathogenic bacteria of cow mastitis %

2.5 藥浴液殺菌效果

本試驗(yàn)研制的成膜性乳頭藥浴液與市售商品化聚乙烯醇(PVA)在5 min時(shí)殺菌對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，海藻酸鈉成膜性藥液殺菌效果良好。

表3 海藻酸鈉成膜性藥浴液5 min殺菌效果Table 3 Comparison of sterilization of sodium alginate film-forming medicated bath with commercially available medicated bath %

2.6 藥浴液臨床應(yīng)用結(jié)果

在天津武清區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，應(yīng)用本試驗(yàn)研制的成膜性乳頭藥浴液后，其臨床乳腺炎發(fā)病率由原來(lái)5%下降到2%，隱性乳腺炎發(fā)病率由原來(lái)的20%下降到8%(見(jiàn)表4)。本試驗(yàn)研制的成膜性乳頭藥浴液表現(xiàn)出良好的預(yù)防乳腺炎發(fā)病效果，具有較好臨床應(yīng)用前景。

表4 海藻酸鈉成膜性藥浴液臨床應(yīng)用效果評(píng)估Table 4 Evaluation of clinical application of sodium alginate film-forming medicated bath %

3 討 論

奶牛乳腺炎是奶牛的常見(jiàn)病，發(fā)病原因較為復(fù)雜，其中環(huán)境性病原微生物是主要生物性因素，而擠奶廳奶牛乳頭后藥浴輔助控制是常用手段之一。目前市售的奶牛乳頭擠后藥浴液成膜基質(zhì)多選用聚乙烯醇(PVA)，除醫(yī)用級(jí)別外，其他級(jí)別的聚乙烯醇曾被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列入三類致癌物質(zhì)清單，因此，篩選出安全級(jí)別更高的成膜基質(zhì)已經(jīng)迫在眉睫。海藻酸鈉具有無(wú)毒、可生物降解、良好生物相容性、緩釋和控釋等特點(diǎn)，主要作肉類制品保鮮可食用涂膜的主要原料[9]。因此，將海藻酸鈉的成膜性和安全性應(yīng)用于奶牛乳頭藥浴液成膜基質(zhì)上，將大幅度提升藥浴液的安全性。

目前市場(chǎng)上商品化奶牛乳頭藥浴液對(duì)奶牛乳腺皮膚組織有一定的損傷和刺激[10]。為研究本成膜藥浴制劑對(duì)奶牛乳房皮膚的刺激性，本試驗(yàn)依據(jù)《中國(guó)獸藥典》(2015)開(kāi)展皮膚的刺激性安全試驗(yàn)。結(jié)果表明，聚維酮碘組家兔皮膚出現(xiàn)不同程度炎癥反應(yīng)，成膜藥浴劑試驗(yàn)組未見(jiàn)明顯可見(jiàn)病理變化。顯微病理切片進(jìn)一步證實(shí)藥浴液組表現(xiàn)輕微血管充血現(xiàn)象，無(wú)組織壞死。說(shuō)明本研究的成膜性藥浴對(duì)動(dòng)物皮膚無(wú)不良刺激，且組分中的潤(rùn)膚成分可很好地保護(hù)乳頭。

據(jù)報(bào)道，鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是引發(fā)我國(guó)奶牛場(chǎng)乳腺炎主要病原菌[11]。對(duì)奶牛乳腺炎常見(jiàn)致病菌的殺菌試驗(yàn)表明，本次研制成膜性乳頭藥浴液在30s時(shí)間節(jié)點(diǎn)均表現(xiàn)出不同程度的殺菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌率100%，無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌殺菌率達(dá)99.99%以上；且在180 d時(shí)同樣表現(xiàn)出了良好的殺菌效果。成膜性乳頭藥浴液除了直接將附著于乳頭部位的細(xì)菌殺死外，同時(shí)形成保護(hù)膜，發(fā)揮物理性屏障作用保護(hù)乳頭，有效減少病原菌進(jìn)入乳房的機(jī)會(huì)，從而降低乳腺炎的發(fā)生概率。該成膜性乳頭藥浴液制劑安全無(wú)刺激性，良好殺菌效果，具有很好的推廣和應(yīng)用前景。