吳妍妍，張文舉*，陳紅莉 ，盧奇成

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000 ；2.新疆天山軍墾牧業(yè)有限責任公司，新疆 石河子 832000)

犢牛作為奶牛養(yǎng)殖業(yè)的后備力量，對于奶牛生產(chǎn)潛力的發(fā)揮具有至關(guān)重要的作用，而犢牛腹瀉(Calf diarrhea)是導致犢牛死亡的主要原因。犢牛腹瀉是一種常見疾病，對犢牛生長發(fā)育危害巨大，其病因復雜，是當前犢牛多發(fā)病之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來較大經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，新疆北疆墾區(qū)規(guī)?；l(fā)病率占 40%～60%，死亡率50%～70%，導致犢牛腹瀉的微生物因素主要有細菌性(平均發(fā)病率36.7%)和病毒性(平均發(fā)病率7.5%)因素。研究發(fā)現(xiàn)引起新疆地區(qū)近兩年來犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌對氨芐西林、慶大霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星等抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。因此，目前迫切需要尋找替代抗生素作為預(yù)防性抗菌藥物的替代方案。為了提高動物福利和保護環(huán)境，飼用微生物因其具有無污染、無殘留、綠色的特點且具有提高畜禽生長性能[1]、優(yōu)化腸道菌群[2-4]、提高動物機體免疫力等[5]生物學功能而備受關(guān)注，許多研究也證實飼用微生態(tài)制劑已被認為是潛在的替代品。

本試驗以分離致病性大腸桿菌K99和實驗室保藏的益生菌為研究對象，比較分析各益生菌株間的生物學特性，篩選出最佳抑制預(yù)防犢牛腹瀉復合微生態(tài)制劑3株菌種的配比優(yōu)化組合。為開發(fā)防治犢牛腹瀉的微生態(tài)制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 益生菌菌株：嗜酸乳桿菌 (Lactobacillusacidophilus)、布氏酵母菌(Saccharomycesboulardii)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，由石河子大學動物科技學院生物飼料實驗室提供。

試驗病菌:大腸桿菌(K99)本實驗室自主分離；沙門氏菌、金黃色葡萄球菌購買于上海魯微科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、芽孢桿菌培養(yǎng)基均購買于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑 PBS緩沖液，用于菌液的稀釋。細菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽購買于Beijing Biotopped Science&Technology Co.，Ltd。生理生化鑒定管購于杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化和活菌含量測定 菌株活化：將3種菌株分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)18h使用接種環(huán)在MRS固體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、芽孢桿菌培養(yǎng)基中涂面和劃線，挑取單個菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基、YPD肉湯培養(yǎng)基、芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)基中，其中嗜酸乳桿菌于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，布氏酵母菌和枯草芽孢桿菌37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，活化2-3代，備用。

活菌含量測定：無菌條件下，將活化2代的益生菌(嗜酸乳桿菌，枯草芽孢桿菌，布氏酵母菌、大腸桿菌)進行梯度稀釋，將懸濁液10倍倍比稀釋至10-7、10-8、10-9，然后取三個稀釋度的菌液各100 μL進行平板涂布，每個稀釋度涂布三個平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12～24 h后，進行菌落計數(shù)。

1.2.2 三種益生菌pH耐受性試驗 人工胃液制備：取質(zhì)量分數(shù)為0.1 kg/L的鹽酸16.4 mL，用酸度計將pH調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0。然后加入胃蛋白酶，比例為0.01 g/mL，待其溶解均勻后，微孔濾膜除菌，備用。將已經(jīng)活化的3株益生菌分別按照1%接種比例接種到上述不同pH的胃蛋白酶溶液中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用酶標儀測定OD600值。

1.2.3 人工腸液耐受性試驗 人工腸液制備:準確稱取KH2P043.4 g，加蒸餾水250 mL溶解，用質(zhì)量分數(shù)4 g/L NaOH溶液調(diào)pH至6.8，加入胰蛋白酶，使其濃度為0.01 g/mL，待其溶解均勻后，微孔濾膜除菌，置于4 ℃冰箱備用。將活化后的3株益生菌菌株分別以10%接種量接入到上述人工腸液中，每個處理重復3次，37 ℃培養(yǎng) ，分別在0、3、6、9小時取樣，用酶標儀測定各菌株的OD600值。

1.2.4 膽鹽耐受性試驗 分別向MRS、YPD、LB液體培養(yǎng)基中添加牛膽鹽，使其配制成牛膽鹽濃度分別為0.15 g/L、 0.3 g/L和0.6 g/L的培養(yǎng)基。然后將3種培養(yǎng)基在118 ℃的條件下滅菌15 min，冷卻之后備用。把上述已活化菌種分別接種到上述配制的相應(yīng)牛膽鹽培養(yǎng)基中，以未加膽鹽的培養(yǎng)基作參照，37 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)8 h，觀察菌種的生長情況，用酶標儀測定OD600值，計算存活率。

1.2.5 體外抑菌試驗 以E.coliK99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌三種致病菌作為指示菌，將其分別37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，按20倍稀釋，取100 μL致病菌液均勻涂布到事先準備好的無菌瓊脂平板上，靜置30 min后，采用打孔法測定抑菌圈，具體是用滅菌的1 mL槍頭分別在已涂布致病菌的平板上打3個孔，直徑約 10 mm，往孔中加入3株益生菌的200 μL無菌體發(fā)酵液(對照組加等量無菌LB液體培養(yǎng)基作對照)，放置37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測定抑菌圈的直徑。

1.2.6 3株菌種抑制大腸桿菌K99的配比優(yōu)化 將活化好的3株益生菌,稀釋為10-1的稀釋懸液。然后再將稀釋至相同濃度(1×109cfu/mL)，按照表1中10種不同配比比例進行接種，對照組接種等量E.coliK99，共11組，每組三個重復，分別加入到一定量的LB液體培養(yǎng)基中，使其終體積為5 mL，于37 ℃ ,165 rpm進行搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)時間設(shè)置為12 h和24 h。之后在超凈工作臺里進行梯度稀釋，取10-6、10-7、10-8100 μL涂布麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，每個重復涂布三個平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行大腸桿菌計數(shù)。

1.4 檢測指標

檢測OD600值及大腸桿菌K99活菌數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)初步用Excel整理，采用Spss21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(ONE-WAY ANONA)和Duncan氏多重比較分析，結(jié)果用“平均值士標準差”表示，P<0.05為差異顯著，并采用GraphPad作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種益生菌人工胃液受性試驗

試驗結(jié)果如圖1、2、3所示，三種益生菌在不同pH值培養(yǎng)條件下都具有較好的耐受性，其中嗜酸乳桿菌在pH為5時，存活率達到了118.75%，在pH為3時，存活率為84.34%。

表1 三種益生菌不同配比的接種量Table 1 Inoculation amount of three probiotics in different proportion

圖1 嗜酸乳桿菌人工胃液不同不同pH耐受性Fig. 1 Tolerance of different pH values of artificial gastric juice for Lactobacillus acidophilus

圖2 枯草芽孢桿菌人工胃液不同不同pH耐受性Fig. 2 Tolerance of different pH values of artificial gastric juice for Bacillus subtilis

圖3 布拉迪酵母菌人工胃液不同不同pH耐受性Fig. 3 Tolerance of different pH values of artificial gastric juice for Saccharomyces boulardii

布氏酵母菌對不同pH均表現(xiàn)成活率達到了100%以上。芽孢桿菌在pH為5時，存活率為142.24%，在不同的pH條件下，存活率均達到了100%以上，具有較好的耐受性。

2.2 三種益生菌人工腸液耐受性試驗

如圖4所示，三種益生菌對人工腸液在不同的培養(yǎng)時間下具有較好的耐受性，三種益生菌在人工胃液中9 h存活率都很高，與0 h的OD600相比，布氏酵母菌和枯草芽孢桿菌存活率分別為108.7%、129.73%，嗜酸乳桿菌達到了96.37%。

圖4 3種益生菌人工腸液不同時間的耐受性Fig. 4 Tolerance of artificial intestinal fluid to three probiotics at different time

2.3 三種益生菌膽鹽耐受性試驗

由圖5可見，隨著牛膽鹽濃度的提高，布氏酵母菌存活率較對照組的存活率分別為50.64%、60.49%、46.37%，嗜酸乳桿菌存活率較對照組分別為81.65%、85.1%、81.19%，芽孢桿菌存活率較對照組的存活率分別為45.1%、45.11%、47.42%。 布氏酵母菌和嗜酸乳桿菌對牛膽鹽的耐受能力較強，而枯草芽孢桿菌較弱。

圖5 3種益生菌牛膽鹽的耐受性Fig. 5 Tolerance of three probiotics to bovine bile salt

2.4 三種益生菌的抑菌性試驗

由表2可見，布氏酵母菌、嗜酸乳桿菌、芽孢桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌均有一定的抑菌特性，嗜酸乳桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌性較強，布氏酵母菌、嗜酸乳桿菌對金黃色葡萄球菌抑菌性較差。

表2 三種益生菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of bacteriostatic circle of three probiotics

2.5 三株菌種抑制大腸桿菌K99的配比優(yōu)化

從表3可以看出，三種益生菌按照不同配比在培養(yǎng)12 h后，試驗組第2、4、8組較對照組相比差異顯著(P<0.05)，第10組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，第1、3、5、6、7、9、10組之間差異不顯著(P>0.05)，與第2、4、8組之間差異顯著(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h后，試驗組第3、4、5、6較對照組差異顯著(P<0.05)，組間差異不顯著(P>0.05)，試驗組第1、9、10較對照組差異不顯著(P>0.05)，試驗組第2、7、8組較對照組差異不顯著(P>0.05)，且組間差異不顯著(P>0.05)。

綜上所述，第8個處理組在培養(yǎng)12 h后對大腸桿菌K99的抑菌效果較好，從而可以確定本試驗中嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布氏酵母菌最佳的復配比例為3∶3∶1。

表3 三種益生菌制劑按不同配比對大腸桿菌k99的體外抑菌試驗(n=3)Table 3 In vitro antibacterial test of three probiotics to Escherichia coli K99 in different proportion(n=3)

3 討 論

3.1 益生菌的益生特性分析

由于本研究是針對犢牛大腸桿菌K99研究復合益生菌，所以根據(jù)初生犢牛的消化系統(tǒng)發(fā)育不完善特點，主要依靠皺胃和小腸來消化吸收日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)，并且在兩周齡以內(nèi)的犢牛不出現(xiàn)反芻行為，其消化功能的特征基本上類似于單胃動物[12]，而此時犢牛的消化道酸度pH波動較大，對其消化生理具有較大的影響，研究表明犢牛進食前后皺胃pH 24 h變化較大，犢牛在飼喂前皺胃pH 在1.5～2.0之間，飼喂之后皺胃pH可以從1.5升高到6.0，之后又會降低到1.5～2.0之間[7]，可見犢牛的皺胃pH在進食前后波動較大，但隨著進食時間也會呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)。犢牛不同腸斷中胰蛋白酶也有所不同，其中十二指腸中活性最低，空腸最高，回腸次之。犢牛腸道內(nèi)膽汁濃度是不斷變化的，因而很難預(yù)測其在某一時間段內(nèi)的濃度，但總的來說，小腸中膽鹽含量通常在0.03%～0.3%[8]。

而益生菌體外鑒定已廣泛應(yīng)用于評價候選菌的益生菌潛能。包括對胃液和膽鹽含量的耐受性、抗菌作用等。益生菌能夠在動物機體存活的一個重要特征是其耐受胃的酸性條件和小腸中膽汁鹽能力[9-10]。本試驗結(jié)果表明三株益生菌嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布氏酵母菌對酸性條件、牛膽鹽、胰蛋白酶的均具有較高的耐受性。

3.2 3種菌株不同配比對大腸桿菌(K99)的抑菌作用

飼用微生物添加劑為一種活性制劑，由于具有綠色、無污染，在促進動物生長、腸道健康等方面的應(yīng)用取得了前所未有的發(fā)展，在操縱宿主的健康軌跡(包括和超越免疫成分)中起著很大的作用，且具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及提高畜禽機體免疫力等生物學功能。

嗜酸乳桿菌是一種典型的益生菌，具有抑制腸道病原體[11-12]、促進免疫細胞的穩(wěn)態(tài)及腸道健康[13-14]、具有抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K99的作用等[15]生理作用。有研究表明嗜酸乳桿菌菌在菌株在pH 3中存活率較高、含有膽鹽的培養(yǎng)基中具有較強的生存能力，且臨界濃度為0.3%，表明該菌株在通過小腸時具有抵抗其抗菌作用的能力。

布氏酵母菌是急性胃腸炎(AGE)中研究得最好的益生菌之一，被證明是安全的[16]。布氏酵母菌具有抗毒素，布氏酵母菌分泌的磷酸酶可以顯著破壞大腸桿菌分泌的內(nèi)毒素[17-19]。對鼠傷寒沙門氏桿菌、大腸桿菌、白色念球菌等具有抑制生長的作用[20]，它能夠提高機體腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的活性，調(diào)節(jié)腸道的代謝功能，促進腸道粘膜的營養(yǎng)效應(yīng)，增強機體的免疫功能，防治病原性感染的作用增加機體SCFA的含量[21]。由于它是好氧菌，并且具有較高的粘附性，能夠消耗腸道內(nèi)的氧氣同時分解過氧化氫，促進厭氧菌的增值[22]，并且能夠調(diào)節(jié)因抗生素使用不當而引起的菌群失衡[23]，從而促進腸道菌群平衡。在家禽、豬、水產(chǎn)上應(yīng)用研究已有相關(guān)報道，但是在反芻動物尤其是犢牛上的研究較少。在犢牛上應(yīng)用具有增加犢牛日增重，降低腹瀉率，提高免疫力等作用[24]。

枯草芽抱桿菌在動物機消化道內(nèi)含量較少。由于其實耗氧菌，能夠快速消耗動物消化道內(nèi)的氧氣，使其產(chǎn)生厭氧的環(huán)境，抑制有害致病菌的生長。同時，芽抱桿菌具有殺菌作用，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中的細菌素能夠有效的抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等病原性菌群的生長，從而維持動物機體的健康。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明,嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布氏酵母菌3株益生菌能夠耐受胃液、腸液和牛膽鹽，對牛源大腸桿菌K99、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，最佳的復配比例為3∶3∶1時具有較好的抑制大腸桿菌K99生長的效果。