羅燕群 李輝斌 黃翠玉 黃莉 朱秀蘭 張曦倩 劉風(fēng)華

(廣東省婦幼保健院 生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 511442)

隨著年齡增加卵子質(zhì)量下降，非整倍體率增加[1,2]，故高齡成為胚胎植入前非整倍性基因測試(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的臨床指征之一。除了高齡是非整倍體發(fā)生的高危因素，另外也有基礎(chǔ)實驗發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的卵母細胞顯示減數(shù)分裂異常或延遲[3]，高脂飲食小鼠的卵母細胞表現(xiàn)出紡錘體缺陷，染色體錯位和非整倍性發(fā)生率更高[4]。因此，近年來體重的改變對生殖的影響也備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)超重和肥胖患者其內(nèi)分泌以及代謝的改變導(dǎo)致不孕癥、自然流產(chǎn)、體外受精-胚胎移植助孕不良的妊娠結(jié)局以及產(chǎn)科并發(fā)癥增加[5-9]。國外研究發(fā)現(xiàn)隨著身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)增加，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)助孕低反應(yīng)周期取消率增加，妊娠率降低，但是在接收贈卵的肥胖受體的薈萃分析發(fā)現(xiàn)BMI增加不會影響IVF-ET結(jié)局，表明卵母細胞質(zhì)量是影響肥胖患者IVF/ICSI結(jié)局的關(guān)鍵因素[10, 11]。但是臨床上婦女體重的異常是否會引起胚胎非整倍體率增加導(dǎo)致妊娠率降低？目前此方面研究尚少，本研究先通過分析反復(fù)種植失敗不同年齡組以及不同體重指數(shù)組患者的非整倍體率的差異，再進一步在不同年齡段分層分析不同體重指數(shù)患者的非整倍體率的情況，希望給反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕前的遺傳咨詢提供有用的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年5月至2020年6月在廣東省婦幼保健院診斷為反復(fù)種植失敗行PGT-A的79個周期資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：①取卵年齡≤39周歲；②診斷為反復(fù)種植失敗的患者，即既往至少3次或以上移植周期(包括新鮮或者凍融胚胎)，累積移植大于等于4個優(yōu)質(zhì)胚胎；③均為新鮮PGT-A周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①男女雙方染色體核型異常；②輸卵管積水；③子宮畸形；④中、重子宮粘連的電切術(shù)后；⑤女方抗心磷脂抗體陽性或者凝血功能異常。廣東省婦幼保健院的倫理委員會審核并批準(zhǔn)本研究，參與患者均知情并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 按取卵年齡分<35歲組和35～39歲組，按BMI分體重過低組(<18.5kg/m2)、正常組(18.5～23.9kg/m2)和超重組(24.0～27.9kg/m2)[12, 13]。

1.2.2 控制性促排卵以及PGT-A胚胎培養(yǎng)和活檢 采用常規(guī)的促排卵方案，當(dāng)1個卵泡直徑≥20mm或者3個以上卵泡直徑≥18 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)6000～10 000U誘導(dǎo)排卵，誘發(fā)排卵后36h取卵。取卵后4～6h常規(guī)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序貫培養(yǎng)(vitrolife G-series)胚胎至第5天或第6天，活檢時間為受精后第5或第6天，活檢部分外胚層細胞(5～10個)送檢?；顧z后的囊胚常規(guī)冷凍保存。

1.2.3 PGT-A檢測 利用胚胎植入前染色體非整倍體檢測的試劑盒(可逆末端終止測序法)進行測序檢測(嘉寶仁和，北京)，再采用SurePlex擴增的試劑盒(Rubicon 公司，美國)對常規(guī)活檢的5～10個滋養(yǎng)外胚層細胞進行全基因組擴增，然后通過基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)分析方法對擴增后的產(chǎn)物進行檢測以及數(shù)據(jù)分析[14]。

1.2.4 PGT-A胚胎檢測數(shù)據(jù)分析以及判讀標(biāo)準(zhǔn) 整倍體囊胚檢測結(jié)果中沒有出現(xiàn)整條染色體異常和片段性異常(>4 Mb)及嵌合情況。非整倍體囊胚：當(dāng)23對染色體中任意一條染色體檢測結(jié)果與參考數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的正常染色體存在顯著差異，即該條染色體拷貝數(shù)異常(包括嵌合情況)。整倍體數(shù)=診斷囊胚數(shù)-非整倍體數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 ≤35歲和35～39歲反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 <35歲患者的BMI、腰圍、腰臀比、抗苗勒管激素、成熟卵數(shù)、囊胚形成數(shù)、活檢囊胚數(shù)、嵌合體率均和35～39歲患者間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但胚胎整倍體數(shù)、整倍體率明顯高于35～39歲患者(P<0.05)。見表1。

表1 <35歲和35～39歲患者的臨床特征和非整倍體比較

2.2 不同體重指數(shù)的反復(fù)種植失敗患者行PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同BMI組間(<18.5、18.5～23.9和24.0～27.9)患者的年齡、基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、2PN卵裂數(shù)、活檢囊胚數(shù)間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，體重指數(shù)18.5～24.0組患者正常受精率、囊胚形成率明顯高于其他2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但是其胚胎整倍體數(shù)、整倍體率和嵌合體率三組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

2.3 小于35歲和35～39歲不同體重指數(shù)的反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同年齡段(年齡<35歲和34～39歲)患者分別統(tǒng)計不同體重指數(shù)組間(<18.5kg/m2、18.5～23.9kg/m2和24.0～27.9kg/m2)患者的年齡、活檢囊胚數(shù)、胚胎整倍體數(shù)、整倍體率和嵌合體率3組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。35～39歲年齡階段的患者體重正?；颊吣遗咝纬陕矢哂隗w重過低和超重患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 ≤34歲和35～39歲不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

3 討論

肥胖不僅導(dǎo)致心血管和腦血管疾病、糖尿病、睡眠呼吸暫停、關(guān)節(jié)炎和癌癥等風(fēng)險增加[15, 16]，而且影響女性的生殖功能，超重同樣產(chǎn)生不良影響。國外研究分析了超重或肥胖對IVF/ICSI助孕結(jié)果的影響提示即使 BMI ≥25kg/m2也與IVF/ICSI治療的妊娠率降低和自然流產(chǎn)率增高有關(guān)[6][11, 17]，以及超重導(dǎo)致種植率明顯降低[18]。也有針對35歲以下IVF助孕患者的研究發(fā)現(xiàn)肥胖影響胚胎質(zhì)量[19]。非整倍體是自然流產(chǎn)以及反復(fù)種植失敗發(fā)生的主要原因之一[20]。隨著年齡的增加非整倍體率增加，2018版的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識提出高齡≥38歲、不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)以及不明原因反復(fù)種植失敗婦女建議行PGS(即PGT-A)助孕篩查整倍體胚胎移植[21]。反復(fù)種植失敗患者中年齡和非整倍體的關(guān)系如何？BMI的異常與非整倍體的發(fā)生是否相關(guān)？本研究針對性先分析了反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕<35歲和≥35～39歲患者非整倍體率的差異，再進一步分析不同體重指數(shù)患者非整倍體的差異。

3.1 不同年齡段反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 由于導(dǎo)致不明原因性反復(fù)種植失敗的機制復(fù)雜，PGT-A篩選整倍體胚胎移植以及提高子宮內(nèi)膜容受性均認為是其治療的主要措施，但如何針對予以行之有效的措施尚有爭議,尤其近期對PGT-A的臨床意義提出了新的質(zhì)疑以及其指征也面臨修改和更新[21-24]。遭遇不明原因性反復(fù)種植失敗的患者選擇行PGT-A助孕的利弊如何？國外研究發(fā)現(xiàn)<35歲、35～37歲、38～39歲和40歲以上囊胚非整倍體的概率分別為40.3%、50.8%、56%和78.3%[2, 25]。國內(nèi)一項針對不同年齡組女性胚胎的非整倍性情況分析發(fā)現(xiàn)>35歲的高齡女性胚胎染色體異常率高于低齡女性[26]，本研究與上述研究一致，我們針對反復(fù)種植失敗PGT-A助孕患者研究發(fā)現(xiàn)<35歲和35～39歲組的囊胚形成率相似，但是整倍體率差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，分別為61.1%和47.0%。因此，遺傳咨詢時，針對性提供患者相應(yīng)年齡段囊胚可能獲得整倍體胚胎的概率，可給患者選擇是否行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查提供幫助。

2.2 不同體重指數(shù)反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 國外研究結(jié)果提示超重或肥胖對生殖系統(tǒng)的不良影響可能與胚胎非整倍性無關(guān)[12]。由于國外與國內(nèi)人種的不同，同時肥胖以及超重的診斷標(biāo)準(zhǔn)和發(fā)生概率也有差異，因此我們也針對體重指數(shù)與非整倍體的關(guān)系進行研究。但由于地理位置關(guān)系，本中心就診的中國南方地區(qū)不孕的肥胖婦女比較少，尤其是因反復(fù)種植失敗行PGT-A的不孕婦女，因此本研究重點探討體重過低、體重正常和超重的反復(fù)種植失敗患者PGT-A助孕周期非整倍體的差異。本研究中無論是否以年齡分層分析得出的結(jié)果均與國外研究一致，認為不同BMI組患者的非整倍體率相似。研究證實卵裂期胚胎的整倍體率是33.3%，明顯低于囊胚的整倍體率60.3%[27]，我們研究發(fā)現(xiàn)35～39歲年齡段的體重正?；颊吣遗咝纬陕拭黠@高于體重過低和超重患者，分析認為囊胚培養(yǎng)過程中一些發(fā)育潛能差的胚胎(包括一些非整倍體胚胎)被淘汰[28]，與Goldman等[12]研究結(jié)果一致認為超重或肥胖對體外受精-胚胎移植助孕結(jié)果的負面影響可能是與胚胎非整倍體以外的因素有關(guān)。因此我們研究認為雖然體重指數(shù)異常可能不影響非整倍體的發(fā)生，但是35～39歲的反復(fù)種植失敗患者行PGT-A助孕前控制體重指數(shù)至正常范圍可能會通過提高囊胚形成率增加整倍體胚胎個數(shù)。

胚胎非整倍體的發(fā)生與眾多因素相關(guān)，例如產(chǎn)婦年齡，精子質(zhì)量和卵母細胞的體外操作等[24]，另外本研究為回顧性隊列分析且樣本量有限等因素可能會對非整倍體的統(tǒng)計分析產(chǎn)生偏倚，因此尚需要設(shè)計良好的前瞻性隨機臨床試驗進行證實。

綜上所述，當(dāng)反復(fù)種植失敗患者年齡增加至35～39歲時整倍體率明顯降低以及體重指數(shù)的異常可能影響囊胚形成率。超重以及體重過低可能不影響反復(fù)種植失敗患者的非整倍體率。