張 菊，魏 丹，張 雪，趙江麗，賈東升

蝙蝠葛堿復合納米膠束的制備及大鼠體內(nèi)藥動學研究

張 菊1，魏 丹1，張 雪2，趙江麗3，賈東升4*

1. 河北經(jīng)貿(mào)大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050072 2. 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 050000 3. 河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北 石家莊 050050 4. 河北省農(nóng)林科學院 經(jīng)濟作物研究所，河北 石家莊 050061

使用聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?）和-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）作為載體材料制備蝙蝠葛堿復合納米膠束（dauricine composite nanomicelles，Dau-CNMs），并通過大鼠ig給藥評價其藥動學情況。采用溶劑蒸發(fā)-薄膜分散法制備Dau-CNMs，通過單因素實驗篩選了Dau-CNMs處方中Soluplus?與TPGS用量配比；分別考察了Dau-CNMs和蝙蝠葛堿單純納米膠束（dauricine single nanomicelles，Dau-SNMs）的微觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位等理化性質(zhì)；并通過MTT法評估了Dau-CNMs的細胞毒性，采用Caco-2細胞單層模型評價了蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs的細胞跨膜轉(zhuǎn)運性質(zhì)；通過大鼠ig給藥比較蝙蝠葛堿混懸液、Dau-SNMs和Dau-CNMs的體內(nèi)藥動學特征。經(jīng)實驗篩選得到Dau-CNMs的最優(yōu)處方：Soluplus?與TPGS用量比為7∶1；在透射電子顯微鏡下可觀察到Dau-SNMs和Dau-CNMs均呈圓整球狀分布；Dau-CNMs的細胞毒性較低，且能夠有效提高藥物的跨膜轉(zhuǎn)運能力；與蝙蝠葛堿混懸液組和Dau-SNMs組比較，Dau-CNMs組大鼠ig給藥顯著提高了藥物達峰濃度和口服生物利用度。以Soluplus?與TPGS作為載體材料，將蝙蝠葛堿制備成復合納米膠束，能夠顯著增加藥物生物利用度。

蝙蝠葛堿；復合納米膠束；溶劑蒸發(fā)-薄膜分散法；藥動學；生物利用度

蝙蝠葛堿（dauricine，Dau）是從防己科植物蝙蝠葛DC.的根莖中提取分離而得到的一種雙芐基四氫異喹啉生物堿，具有廣譜的抗心律失?；钚?，臨床上用于治療快速型心律失常[1]。然而，蝙蝠葛堿為弱堿性藥物[2]，其溶解性具有pH依賴性，在酸性環(huán)境中藥物以離子化形式存在，溶解性較好，但是在中性或弱堿性環(huán)境中溶解度較低，這會導致原本已經(jīng)溶解在胃液中的蝙蝠葛堿隨著胃排空作用在進入小腸時沉淀析出[3]，另外，蝙蝠葛堿是P-糖蛋白（P-gp）底物[4-6]，腸道吸收后存在外排作用，口服生物利用度較低（15%～19%）[7]，生物變異性較大，臨床療效不確切。

由高分子聚合物和/或表面活性劑形成的膠束可以抑制藥物在進入小腸后成核和晶體生長，保持穩(wěn)定的過飽和狀態(tài)，防止藥物析出沉淀[8-9]，在改善弱堿性藥物的體外溶出度和增強其生物利用度方面顯示出巨大潛力[10-11]。聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?）是巴斯夫公司開發(fā)出的一種非離子型高分子型聚合物載體，其溶解性不隨胃腸道pH值而改變，且Soluplus?具有一定的表面活性劑作用，可提高難溶性藥物的溶解 度[12-13]；-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）屬于非離子表面活性劑，文獻報道[14-15]TPGS能夠抑制P-gp對底物的外排作用，改變生物膜的流動性，提高藥物生物利用度，作為一種安全的藥用輔料已被FDA批準用于藥品中，而以Soluplus?/TPGS形成的復合膠束能夠顯著改善難溶性弱堿性藥物的口服生物利用度和治療效果[16]。為此，本研究以Soluplus?與TPGS作為載體材料，將蝙蝠葛堿制備成復合納米膠束（Dau-CNMs），并通過大鼠體內(nèi)藥動學評估藥物生物利用度，為蝙蝠葛堿的口服新劑型研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

RIGOL L-3000高效液相色譜系統(tǒng)，蘇州普源精電科技有限公司；AE523電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；DF-101T-予華集熱式恒溫加熱磁力攪拌器大容量，鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Zetasizer Nano ZSE納米粒度儀，英國馬爾文公司；HT7700型透射電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司；GL-25MS超速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；LHS-150SC恒溫恒濕箱，上?？德穬x器設備有限公司。

蝙蝠葛堿原料藥，上海信裕生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)為99.1%，批號SBJ180712；蝙蝠葛堿對照品，中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)為98.5%，批號111867-201804；聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus?），德國巴斯夫公司，批號23597797V0；TPGS，嘉法獅上海貿(mào)易有限公司，批號T110277；二氯甲烷，百靈威化學試劑公司，批號SA2SF11714；四甲基偶氮唑鹽（MTT），百靈威化學試劑公司，批號A100793-0001。

Caco-2細胞，河北醫(yī)科大學細胞實驗室提供；Wistar大鼠，體質(zhì)量為（220±20）g，雌雄各半，SPF級，河北醫(yī)科大學動物實驗中心，合格證號1910017，許可證號SCXK（冀）2019-1-003。所有動物實驗遵循河北醫(yī)科大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Dau-CNMs和Dau-SNMs的制備

本研究通過溶劑蒸發(fā)-薄膜分散法制備Dau- CNMs或Dau-SNMs，按照一定質(zhì)量比例稱取Soluplus?和/或TPGS至100 mL梨形瓶中，加入10 mL二氯甲烷溶解，再稱取處方量的蝙蝠葛堿加入到上述溶液中溶解，將梨形瓶固定到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在一定水浴溫度下旋蒸揮干二氯甲烷，在瓶壁內(nèi)側(cè)形成一層透明薄膜，減壓干燥1 h，放入到真空烘箱中過夜；加入去離子水50 mL水化薄膜，并保持外界水浴溫度與內(nèi)水相溫度一致，同時進行磁力攪拌，速率為500 r/min，持續(xù)水化攪拌30 min，即形成淡藍色溶液，樣品溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，并加入去離子水至體積為50 mL，即得到Dau-CNMs（加TPGS）或Dau-SNMs（不加TPGS）。

2.2 包封率測定

取Dau-CNMs或Dau-SNMs 2.0 mL加入到截留相對分子質(zhì)量為10 000的超濾離心管上端，密封，放入到離心機中，在5000 r/min下離心20 min，收集離心管底端中超濾液置10 mL量瓶中，加入流動相定容（游離）；另取Dau-CNMs或Dau-SNMs 1.0 mL置50 mL量瓶中，加入乙腈5 mL，水浴超聲5 min，加入流動相定容（總）。檢測上述2種溶液中的藥物含量，并計算藥物包封率：

包封率＝1－游離/總

2.3 Dau-CNMs處方篩選

2.3.1 臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）測定 聚合物在溶液中的濃度只有超過CMC值才能形成膠束，而具有較低CMC值的聚合物其形成的膠束在進入體內(nèi)后可避免由于體液稀釋而破壞其完整性[17]，因此，CMC成為評估膠束穩(wěn)定性的重要參數(shù)。

本研究采用芘熒光光譜法測定單一或復合聚合物的CMC值[18]。具體操作如下：配制濃度為6 μmol/L芘的丙酮溶液，精密移取0.1～10 mL棕色量瓶中，氮氣吹干丙酮，平行制備7份樣品；另按照表1的處方配比配制一系列質(zhì)量濃度的單一或復合聚合物溶液，加入到上述含芘的量瓶中，定容，使芘在各聚合物樣品中的濃度為0.06 μmol/L，每個量瓶中放入一個磁力攪拌子，持續(xù)攪拌48 h確保平衡，分別取樣測定各樣品溶液進行熒光光譜法掃描，記錄第1特征峰373 nm與第3特征峰384 nm的熒光強度（）之比（373/384），聚合物的CMC值由熒光強度比（373/384）與聚合物質(zhì)量濃度對數(shù)值（lg）的關系圖中的交叉點確定，不同配比Soluplus?與TPGS形成的CMC值見表1。

表1 不同配比Soluplus?與TPGS的CMC測定結(jié)果

從實驗結(jié)果可知，TPGS具有較高的CMC值，為0.215 mg/mL，形成膠束需要TPGS質(zhì)量濃度較大；而Soluplus?具有極低的CMC值，為0.007 mg/mL；另外，隨著Soluplus?與TPGS的配比由1∶3增加到9∶1，形成的復合納米膠束的CMC值逐漸降低，說明其形成膠束逐漸具有了較強的抗稀釋能力和穩(wěn)定性。

2.3.2 納米膠束制劑性質(zhì)研究 膠束具有極小的粒徑分布，可顯著提高難溶性藥物溶解度，并容易透過細胞膜，是提高生物利用度極具有前途的口服給藥系統(tǒng)[19]。按照“2.1”項下方法制備Soluplus?與TPGS不同配比的蝙蝠葛堿納米膠束，并評價制劑學性質(zhì)，結(jié)果見表2。

由實驗結(jié)果可知，單獨以TPGS制備的膠束（Dau-SNMs）粒徑較大，這是由于TPGS的CMC值較高，溶液中需要較高質(zhì)量濃度的TPGS才能形成膠束，因此，TPGS形成的納米膠束粒徑較大[20]；而相反，Soluplus?具有極低的CMC值，在較低的質(zhì)量濃度下即可形成納米膠束（Dau-SNMs），因此Soluplus?形成的納米膠束粒徑較小[21]；Soluplus?與TPGS的配比由1∶3增加到9∶1，形成的Dau- CNMs的粒徑和PDI均呈減小趨勢，在Soluplus?與TPGS配比為7∶1時制備的復合納米膠束粒徑較小，而包封率隨著Soluplus?與TPGS的配比的增加而增大；Soluplus?與TPGS的配比對復合納米膠束的Zeta電位影響較小。

表2 Soluplus?與TPGS不同配比對復合納米膠束制劑性質(zhì)影響(, n = 3)

2.3.3 藥物泄漏率測定 膠束在進入體內(nèi)被體液稀釋后藥物可能會發(fā)生泄漏，尤其是對于弱堿性藥物，泄漏的藥物在進入腸道中有可能析出藥物沉淀，不利于藥物吸收，影響藥物生物利用度[8]。為了考察Dau-CNMs和Dau-SNMs在胃腸道環(huán)境中的藥物泄漏率，分別選擇pH 1.2鹽酸溶液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液作為模擬介質(zhì)進行藥物泄漏率考察，具體操作如下：取不同配比Soluplus?與TPGS形成的Dau- CNMs以及Dau-SNMs各5 mL，分別加入到pH 1.2鹽酸溶液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中，體積均為50 mL，放置在37 ℃水浴中持續(xù)振蕩。在pH 1.2鹽酸溶液介質(zhì)中的樣品振蕩2 h后取樣，經(jīng)超濾離心，取超濾液測定游離藥物含量[22]；而在pH 6.8磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中的樣品振蕩24 h后取樣，在轉(zhuǎn)速為5000 r/min下離心20 min，取上清液1 mL加入到10 mL量瓶中，乙腈破乳并定容，檢測藥物含量，計算藥物泄漏率[22]，結(jié)果見表3。

表3 不同配比Soluplus?與TPGS形成膠束的藥物泄漏率測定結(jié)果(, n = 3)

通過實驗結(jié)果可知，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中不同配比的Dau-CNMs的藥物泄漏率隨著Soluplus?與TPGS配比的增加而降低，即Soluplus?與TPGS的配比由1∶3增加到9∶1時，Dau-CNMs中藥物泄漏量由（76.4±0.8）%降低到（4.3±0.4）%，這主要是由于藥物在中性環(huán)境中溶解度較低所致；而在pH 1.2鹽酸溶液中，隨著Soluplus?與TPGS配比的增大，可以有效地減少藥物在酸性環(huán)境中的泄漏，這可能是由于藥物的非極性烴鏈和Soluplus?的疏水鏈之間的相互作用增加了藥物與Soluplus?之間的親和力，使藥物更傾向于被包裹在膠束中，從而抑制了藥物的泄漏。

2.3.4 體外藥物沉淀率研究 由于蝙蝠葛堿在低pH環(huán)境中溶解度較高，而在中性環(huán)境中溶解度迅速降低，因此Dau-CNMs在pH值較低的胃液環(huán)境藥物發(fā)生泄漏，泄露的藥物在進入腸道時容易析出沉淀，不利于藥物吸收，因此，通過體外模擬實驗考察了Dau-CNMs中的藥物沉淀現(xiàn)象，實驗操作如下：取700 mL pH 1.2鹽酸溶液加入到溶出杯中，攪拌速度調(diào)至50 r/min，水浴溫度為37 ℃，分別取不同配比Soluplus?與TPGS制備Dau-CNMs以及Dau- SNMs各5 mL加入到溶出杯中，持續(xù)攪拌2 h后，取同溫度下濃度為0.2 mol/L磷酸鈉溶液快速加入到溶出杯中，并調(diào)節(jié)pH值至6.8，并繼續(xù)攪拌3 h，且在預定的時間間隔（15、120、150、180、240、300 min）取樣5 mL（同時補加同溫同體積pH 1.2鹽酸溶液或pH 6.8磷酸鹽緩沖液），經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液1 mL加入到10 mL量瓶中，乙腈破乳并定容，檢測藥物含量[22]，計算藥物沉積率，結(jié)果見圖1。

圖1 蝙蝠葛堿原料藥、不同配比Dau-CNMs以及Dau- SNMs的沉淀率比較(, n = 3)

實驗結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿原料藥及所有的Dau- CNMs和Dau-SNMs在pH 1.2鹽酸溶液中放置2 h，均無藥物沉淀析出；而在溶出介質(zhì)pH值調(diào)節(jié)到6.8后，不同配比的Dau-CNMs中的藥物析出沉淀量具有一定的差異性，當Soluplus?與TPGS的比例為7∶1、9∶1以及采用單獨Soluplus?的處方，藥物析出沉淀量最小，且在300 min后兩者的藥物的沉淀量無顯著差異，這可能由于Soluplus?的CMC較低，當溶出介質(zhì)pH值增加到6.8后，Soluplus?仍以膠束形式存在，可溶解部分藥物，避免藥物因溶解度變低析出沉淀，或者是由于藥物中的氨基和Soluplus?中的羥基形成了共價鍵，可以進一步抑制藥物沉淀。

根據(jù)上述研究結(jié)果，同時考慮到需要提高處方中TPGS的比例以抑制P-gp對藥物的外排作用，因此，本研究確定Soluplus?與TPGS的比例為7∶1作為最終處方制備Dau-CNMs的處方組成。

2.4 Dau-CNMs膠束粒徑和Zeta電位測定

使用Zetasizer Nano ZS動態(tài)激光散射儀測定Dau-CNMs和Dau-SNMs的粒徑分布、多聚分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位。經(jīng)測定Dau-CNMs的平均粒徑為（73.9±6.2）nm，PDI為0.104±0.013，其Zeta電位為（2.01±0.23）mV，表面電荷近似于電中性，這有助于膠束直接穿過胃腸道的黏液層，促進藥物跨膜轉(zhuǎn)運與吸收[23]；另外，Dau-SNMs的粒徑為（76.3±4.8）nm，PDI為0.116±0.012，Zeta電位為（2.32±0.46）mV，說明TPGS的加入對膠束的粒徑和表面電荷沒有明顯影響。

2.5 TEM觀察

TEM觀察了Dau-CNMs和Dau-SNMs的微觀形態(tài)。取少量上述2種膠束溶液，分別用去離子水稀釋，各取少量溶液置于涂膜的銅網(wǎng)上，揮干水分，將銅網(wǎng)浸入到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的磷鎢酸溶液中，負染10 min，取出后自然晾干，在TEM觀察Dau-CNMs和Dau-SNMs的微觀形態(tài)，結(jié)果見圖2。

在TEM下可觀察到Dau-CNMs和Dau-SNMs均為球形，粒徑大部分在30～60 nm，說明TPGS的加入對膠束的形態(tài)沒有明顯影響；此外，在TEM下粒徑分布偏小，這可能是由于膠束干燥失水導致的[24]。

圖2 Dau-CNMs (A) 和Dau-SNMs (B) 的TEM照片

2.6 細胞毒性評價

通過MTT法評價了蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs對Caco-2細胞的安全質(zhì)量濃度范圍。取Caco-2細胞在含有20%胎牛血清（FBS）和1%鏈霉素的培養(yǎng)基中孵育。取96孔板每個孔加入Caco-2細胞約為5×104個，并在37 ℃，5% CO2下孵育24 h，向96孔板細胞中分別加入DMSO溶液（作為對照）、蝙蝠葛堿DMSO溶液、Dau-SNMs和Dau-CNMs，使藥物質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100 μg/mL，每個藥物質(zhì)量濃度設置3個重復孔，繼續(xù)在37 ℃下孵育24 h，吸取培養(yǎng)基，每孔加入50 μL MTT溶液（質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）和80 μL新鮮培養(yǎng)基，37 ℃下孵育4 h，棄去含有MTT的培養(yǎng)基，并向每個孔中加入150 μL DMSO以溶解甲臜沉淀，使用酶標儀在490 nm波長下測定各孔的吸光度（）值，并根據(jù)值計算細胞存活率，結(jié)果見圖3。

細胞存活率＝實驗/對照

圖3 蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs對Caco-2細胞的毒性(, n = 3)

實驗結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs對Caco-2細胞的毒性均表現(xiàn)出質(zhì)量濃度相關性，細胞活性與質(zhì)量濃度呈負相關，但是在實驗的藥物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細胞活性均高于80%，表明蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的生物相容性。

2.7 細胞轉(zhuǎn)運研究

Caco-2細胞單層是細胞轉(zhuǎn)運實驗中最廣泛的模型，用于評估P-gp的外排作用。Caco-2細胞經(jīng)孵育3周后，測得跨上皮細胞電阻值為（345.4±31.8）Ω/cm2，表明已成功構(gòu)建了致密的Caco-2單層細胞模型[25]，可用于評價Dau-CNMs從頂端到基底外側(cè)（AP→BL）和基底外側(cè)到頂端（BL→AP）的轉(zhuǎn)運實驗。配制含有不同質(zhì)量濃度的蝙蝠葛堿原料藥、Dau-SNMs和Dau-CNMs的漢克平衡鹽溶液（HBSS）作為供試液，分別取各組溶液1.0 mL加入到Caco-2單層細胞的AP側(cè)（或BL側(cè)），并向BL側(cè)（AP側(cè)）加入2.5 mL空白HBSS作為接收液，以固定的時間間隔內(nèi)從BL側(cè)（AP側(cè)）取0.3 mL接收液（同時補加同體積空白HBSS）。樣品經(jīng)HPLC法測定藥物含量，按照公式計算表觀滲透系數(shù)（app）和外排比（ER）。結(jié)果見圖4。

app＝d/(0d)

ER＝app(BL→AP)/app(AP→BL)

d/d是接收液中蝙蝠葛堿的穩(wěn)態(tài)透過率，0是供試液中蝙蝠葛堿的初始質(zhì)量濃度，是Caco-2單層細胞面積，app(BL→AP)是蝙蝠葛堿從BL端轉(zhuǎn)運到AP端的app值，app(AP→BL)是蝙蝠葛堿從AP端轉(zhuǎn)運到BL端的app值

與蝙蝠葛堿原料藥比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與Dau-SNMs比較：##P＜0.01

ER值通常用于評估P-gp的抑制作用，如果藥物的ER值大于2，說明該藥物很可能是P-gp的底物[26]。本實驗結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿原料藥組從基底外側(cè)到頂端（BL→AP）的app(BL→AP)值為（28.5±0.9）×10?6cm/s，而從頂端到基底外側(cè)（AP→BL）的app(AP→BL)值為（3.8±0.7）×10?6cm/s，ER值為7.5，該結(jié)果與文獻報道一致[27]，說明蝙蝠葛堿是P-gp底物，蝙蝠葛堿被腸細胞吸收后又會泵送腸道內(nèi)；與蝙蝠葛堿原料藥組相比，Dau-SNMs組的app(BL→AP)值出明顯的降低趨勢，從（28.5±0.9）×10?6cm/s降至（23.8±1.5）×10?6cm/s，而app(AP→BL)值則出明顯的增加趨勢，從（3.8±0.7）×10?6cm/s增加到（5.7±0.8）×10?6cm/s，其ER值為4.2，與蝙蝠葛堿原料藥組相比降低了1.8倍，說明Dau-SNMs抑制了P-gp的外排作用，這可能是由于Dau-SNMs的粒徑較小，可通過細胞內(nèi)吞作用穿過生物膜[28]，降低了P-gp對藥物的識別能力，從而抑制了P-gp對藥物的外排作用；Dau-CNMs組的app(BL→AP)和app(AP→BL)值分別為（12.7±1.1）×10?6cm/s和（11.4±1.4）×10?6cm/s，其ER值為1.1，分別比蝙蝠葛堿原料藥組和Dau-SNMs組降低了6.8倍和3.8倍，這是由于處方中加入TPGS，能夠顯著抑制了P-gp的活性，降低了P-gp對蝙蝠葛堿的外排作用[29]，另外Dau-CNMs通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，其包裹的蝙蝠葛堿不會被P-gp識別，進一步降低P-gp對蝙蝠葛堿的外排作用。

2.8 大鼠體內(nèi)藥動學研究

2.8.1 色譜和質(zhì)譜條件[30]色譜柱為Waters Xterra MS C18（150 mm×3.9 mm，5 μm），流動相為乙腈- 2 mmol/L甲酸銨溶液（65∶35），體積流量為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL；離子源為電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為110 ℃，電壓為3500 V，離子源氣體（N2）壓力為413.685 kPa（60 psi），碰撞氣體壓力為34.474 kPa（5 psi），掃描方式為多離子反應監(jiān)測，用于定量分析的離子反應為質(zhì)荷比，/625→206（蝙蝠葛堿，待測物），/623→174（粉防己堿，內(nèi)標）。

2.8.2 血漿樣品前處理 精密量取大鼠血漿0.1 mL，加入質(zhì)量濃度為3.000 μg/mL的粉防己堿甲醇溶液5 μL作為內(nèi)標，渦旋復合，加入醋酸乙酯1.0 mL，渦旋復合，萃取藥物，離心，取上清液，氮氣吹干，殘渣用100 μL流動相復溶，按照“2.8.1”項下色譜條件檢測藥物含量，計算藥物質(zhì)量濃度。

2.8.3 標準曲線及方法學驗證 精密量取大鼠空白血漿0.1 mL，加入系列質(zhì)量濃度的蝙蝠葛堿甲醇溶液各5 μL，渦旋復合，配制成含有蝙蝠葛堿質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100、250、500 ng/mL，加入內(nèi)標溶液，渦旋復合，按照“2.8.1”項下方法操作，進樣檢測，以主藥峰面積（s）與內(nèi)標物峰面積（i）之比作為縱坐標，以主藥質(zhì)量濃度（）為橫坐標，得到線性回歸方程為s/i＝0.067 9－0.004 6，＝0.999 7，線性關系良好。

另配制蝙蝠葛堿甲醇溶液質(zhì)量濃度分別為5、50、500 ng/mL血漿樣品，每個質(zhì)量濃度樣品重復制備6份，均加入內(nèi)標溶液，渦旋復合，按照“2.8.2”項下方法操作，進樣檢測，考察方法精密度和提取回收率。結(jié)果顯示，低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品的精密度RSD分別為7.9%、8.2%、6.7%，提取回收率分別為86.4%、93.7%、95.1%，說明本方法重現(xiàn)性好，提取回收率高。

2.8.4 動物實驗 取Wistar大鼠18只，體質(zhì)量為（220±20）g，雌雄各半，禁食過夜，可自由飲水。將大鼠隨機分為A、B、C 3組，A組大鼠經(jīng)喂食針給予蝙蝠葛堿混懸液（分散介質(zhì)為0.25%羧甲基纖維素鈉），B組大鼠給予Dau-SNMs，C組大鼠給予Dau-CNMs，給藥劑量均為50 mg/kg，并在0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、24 h通過眼眶后神經(jīng)叢采集血樣0.5 mL，離心，收集上層血漿于?20 ℃下冷凍保存，測定前室溫解凍，按照“2.8.2”項下方法操作，進樣檢測藥物含量，WinNonlin軟件計算藥動學參數(shù)（表4），并繪制血藥濃度–時間曲線圖（圖5）。

表4 大鼠藥動學參數(shù)(, n = 6)

與蝙蝠葛堿混懸液組比較：#＜0.05；與Dau-SNMs組比較：Δ＜0.05

#< 0.05dauricine suspension group;Δ< 0.05Dau-SNMs group

圖5 血藥濃度-時間曲線圖(, n = 6)

大鼠體內(nèi)藥動學結(jié)果顯示，與蝙蝠葛堿混懸液組相比，Dau-SNMs組和Dau-CNMs組的血藥濃度曲線下面積（AUC0～∞）均顯著提高，分別是蝙蝠葛堿混懸劑組的1.79倍和2.75倍，說明Dau-SNMs和Dau-CNMs均可以顯著提高了蝙蝠葛堿的口服生物利用度；且Dau-SNMs組和Dau-CNMs組的血藥峰濃度（max）分別是蝙蝠葛堿混懸劑組的1.97倍和2.93倍，2種納米膠束也均提高了蝙蝠葛堿的達峰濃度。

另外，Dau-CNMs組的AUC0～∞與max分別是Dau-SNMs組的1.53倍和1.49倍，說明Dau-CNMs提高蝙蝠葛堿的口服生物利用度更為顯著，這歸因于Dau-CNMs的處方中的TPGS，有效抑制了腸上皮細胞膜中的P-gp的活性，降低了對蝙蝠葛堿的外排作用，提高了藥物生物利用度。

3 討論

Caco-2細胞在形態(tài)上與人的小腸上皮細胞相似，并且包含與小腸刷狀緣上皮細胞相關的酶，因此Caco-2單層細胞模型被認為是體外模擬人類腸道吸收的可靠模型。P-gp是Caco-2細胞膜中的主要轉(zhuǎn)運蛋白，其正常表達可有效保護人體免受外源有害物質(zhì)的侵害，P-gp參與藥物的腸道吸收，并表現(xiàn)出顯著的劑量和部位的吸收相關性。然而P-gp過表達時會誘導反向轉(zhuǎn)運，從而影響藥物的吸收，分布，代謝和消除過程，TPGS是一種安全的表面活性劑，它不僅可以促進內(nèi)吞作用，而且有效抑制P-gp的外排泵作用。本研究中，在Dau-CNMs中加入TPGS，其目的是以減少P-gp對蝙蝠葛堿的外排作用，促進藥物吸收。

影響藥物口服生物利用度的2個關鍵參數(shù)是藥物在胃腸道中的溶解度和藥物通過腸膜的滲透性，生物利用度低，說明該藥物不能被吸收到血液中，導致療效差。本研究以Soluplus?與TPGS作為載體材料，將蝙蝠葛堿制備成復合納米膠束，一方面，處方中的Soluplus?能夠有效抑制因pH值環(huán)境變化導致藥物沉淀析出，另一方面，處方中的TPGS能夠抑制P-gp對藥物的外排作用，提高了藥物的滲透性，最終通過體內(nèi)藥動學實驗證實Dau-CNMs能夠有效提高藥物生物利用度。本研究為改善蝙蝠葛堿的生物利用度提供一種有效的解決方案，也對同類型藥物的二次開發(fā)起到一定的借鑒作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and pharmacokinetic evaluation of dauricine composite nanomicelles in rats

ZHANG Ju1, WEI Dan1, ZHANG Xue2, ZHAO Jiang-li3, JIA Dong-sheng4

1. College of Biology Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang 050072, China 2. Department of Medical Oncology, Hebei Medical University Fourth Affiliated Hospital, Shijiazhuang 050000, China 3. Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050050, China 4. Institute of Cash Crop, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050061, China

To prepare dauricine composite nanomicelles (Dau-CNMs) using polyethylene caprolactam-polyvinyl acetate-polyethylene glycol graft copolymer (Soluplus?) and-α-tocopherol polyethylene glycol succinate (TPGS) as carrier materials and evaluate its pharmacokinetics in rats.The Dau-CNMs were prepared by solvent evaporation-film dispersion method. The amount ratio of Soluplus?and TPGS in the Dau-CNMs formulation was screened by single factor experiment. The microscopic morphology, particle size distribution, Zeta potential of Dau-CNMs and dauricine single nanomicelles (Dau-SNMs) were investigated, respectively. The cytotoxicity of Dau-CNMs was evaluated by MTT method. The Caco-2 cell monolayer model was used to evaluate the transmembrane transport properties of dauricine, Dau-SNMs and Dau-CNMs. Thepharmacokinetic characteristics of dauricine suspension, Dau-SNMs and Dau-CNMs after intragastric administration in rats were compared.The optimal formulation of Dau-CNMs as followed:The dosage ratio of Soluplus?and TPGS was 7:1. It could be observed under the transmission electron microscope that Dau-CNMs and Dau-SNMs are distributed in a round spherical shape. Dau-CNMs had low cytotoxicity and could effectively improve the dauricine transmembrane transport ability. Compared with dauricine suspension and Dau-SNMs, Dau-CNMs significantly improved the peak concentration and bioavailability of dauricine.This study uses Soluplus?and TPGS as carrier materials to prepare dauricine composite nanomicelles, which could significantly increase the bioavailability of dauricine.

dauricine; composite nanomicelles; solvent evaporation-film dispersion method; pharmacokinetics; bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2021)08 - 2276 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.010

2020-12-01

河北省自然科學基金項目（H2020207002）；河北省高等學?？茖W技術研究項目（ZD2018013）；河北經(jīng)貿(mào)大學科研基金重點項目（2017KYZ05）

張 菊（1987—），女，博士，講師，研究方向為中藥活性成分的藥理學及藥動學。

賈東升（1982—），男，博士，副研究員，主要從事藥用植物加工及開發(fā)研究。Tel: (0311)87652129 E-mail: jiads1@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]