孫 平，喬炳龍，李 超，詹 瑛，趙 蕾，張昊旻

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 a.產(chǎn)科;b.放射科，青島 266003;2.青島市第三人民醫(yī)院產(chǎn)科，青島 266041;.諸城市婦幼保健院，諸城 262200)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)目前被列為糖尿病的一個(gè)獨(dú)立的亞類，由不同的機(jī)制引起和發(fā)展，需特定的診斷和治療方法[1]。GDM可能起源于特定的基因突變和(或)胎盤激素失調(diào)和β細(xì)胞損傷，并且在高齡及致糖尿病因素，如高體重指數(shù)(body mass index,BMI)、高齡產(chǎn)婦和糖尿病家族史背景下更易發(fā)生[2]。隨著妊娠的進(jìn)展，機(jī)體的胰島素敏感性降低，靜息血糖水平升高。為了維持標(biāo)準(zhǔn)的血糖水平，機(jī)體通過(guò)增加胰島素分泌進(jìn)行補(bǔ)償，當(dāng)機(jī)體不再適應(yīng)新的環(huán)境，內(nèi)分泌系統(tǒng)無(wú)法產(chǎn)生足夠的胰島素時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致GDM的發(fā)生[3]。此外，高水平的激素，如孕酮和胎盤催乳素，可促進(jìn)胰島素抵抗，并導(dǎo)致妊娠期高血糖，誘發(fā)GDM發(fā)生[4]。目前，胰島素被推薦為GDM的一線治療藥物。據(jù)證據(jù)表明，胰島素類似物(短效和長(zhǎng)效)是妊娠期間人胰島素的安全替代品[5]。二甲雙胍和格列本脲(在美國(guó)和加拿大稱為格列本脲)是目前唯一用于治療GDM的口服藥物。據(jù)研究顯示，在隨機(jī)二甲雙胍GDM試驗(yàn)中，二甲雙胍和胰島素治療組圍產(chǎn)期并發(fā)癥發(fā)生率(32.0% vs 32.2%)或不良事件發(fā)生率無(wú)明顯差異，然而仍有46%的二甲雙胍組患者需增加胰島素治療達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)血糖水平[6]。

褪黑素是一種親脂性激素，主要在松果體中合成和分泌，被認(rèn)為是一種晝夜節(jié)律和晝夜節(jié)律光周期的神經(jīng)內(nèi)分泌傳感器。褪黑素具有抗氧化作用，比維生素C和E具有更高的功效，可與其代謝產(chǎn)物一起直接去除活性氧(reactive oxygen species，ROS)，增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)等幾種抗氧化酶的基因表達(dá)，抑制促氧化酶，減少細(xì)胞氧化損傷[7-8]。褪黑素在線粒體中高度集中，可保護(hù)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA免受氧化損傷[9]。有研究顯示，褪黑素可在小鼠腦線粒體中合成，并通過(guò)線粒體外膜褪黑素受體(melatonin receptor，MTNR)發(fā)揮作用，防止細(xì)胞色素C滲漏及隨后的細(xì)胞凋亡[10]。有證據(jù)表明，褪黑素在控制血糖方面具有有益作用。在松果體切除動(dòng)物中，褪黑素治療能緩解葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4型(glucose transporter 4,GLUT4)基因的表達(dá)水平降低所致的葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗[11]。在鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，胰島素和褪黑素共同治療8周可改善白色脂肪組織的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性[12]。此外，褪黑素作為一種優(yōu)良的鐵死亡抑制劑，具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括高脂溶解度、低毒性和高滲透性通過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜[13]。研究顯示，褪黑素具有抗凋亡、抗炎和抗氧化作用，但GDM中潛在的鐵死亡相關(guān)的抗糖尿病機(jī)制仍不清楚。目前研究中，假設(shè)褪黑素在GDM中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究通過(guò)構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的GDM模型，檢測(cè)了褪黑素治療對(duì)GDM病理改變的影響，包括組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及鐵死亡通路蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24只雌性SD大鼠(體重180～220g)購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心。將大鼠隨機(jī)分成4組：正常妊娠組(control group)，妊娠糖尿病模型組(GDM組)，妊娠糖尿病模型組+褪黑素低劑量組(GDM+LM組)，妊娠糖尿病模型組+褪黑素高劑量組(GDM+HM組)。

1.1.2 試劑及設(shè)備 ELISA試劑盒(Boster,中國(guó))，兔抗-ACSL4抗體、兔抗-GPX4抗體(Abclonal，中國(guó))，兔抗-MTR1B抗體、兔抗-FTH1抗體(Affinity，美國(guó))，兔抗-GAPDH抗體(杭州賢至，中國(guó))，TRIzol試劑(Invitrogen,美國(guó))，PCR引物(Sangon Biotech，中國(guó))，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Solarbio,中國(guó))，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京普利萊,中國(guó))，PVDF膜(Millipore，美國(guó))，ABI PRISM 7900 PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))，顯微鏡(Olympus CX23，日本)，熒光顯微鏡(Leica DM4000 B，德國(guó))，自動(dòng)生化分析儀(Hitachi,日本)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建大鼠GDM模型 雌性大鼠經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，測(cè)量體重，按雌雄2∶1比例合籠，次日清晨將雌雄大鼠分開(kāi)，用棉簽取雌性大鼠陰道分泌物，涂在滴有PBS的干凈玻璃片上，顯微鏡下觀察是否有精子，有精子的記做妊娠D0。確定妊娠后，腹腔注射45mg/kg STZ溶液誘導(dǎo)妊娠糖尿病模型。24h后檢測(cè)血糖濃度，≥11.1mmol/L的大鼠即造模成功。STZ注射4d后，開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)[褪黑素5mg/(kg·d)和10mg/(kg·d)]，持續(xù)14d后處死。取大鼠胰腺組織、血液樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察 采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察。胰腺組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，將組織包埋于石蠟,切成1cm小塊，用蘇木精和伊紅染色，在生物光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織形態(tài)。

1.2.3 大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) TUNEL染色法檢測(cè)胰腺組織中的凋亡細(xì)胞。熒光顯微圖像的觀察及采集使用Olympus IX51倒置顯微鏡系統(tǒng)(Olympus，Japan)，在400放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，每個(gè)樣本選擇3個(gè)不同的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/mm2預(yù)測(cè)胰腺組織損傷的嚴(yán)重程度。陰性對(duì)照采用不含TUNEL試劑的標(biāo)記液。

1.2.4 大鼠血清及胰腺組織生化分析 采用LX20自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中葡萄糖、胰島素及糖化血紅蛋白水平;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)大鼠胰腺組織中SOD、H2O2、CAT、GSH-PX、GSH、MDA水平;比色法檢測(cè)胰腺組織含鐵水平。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)大鼠胰腺組織中鐵死亡通路相關(guān)基因的mRNA水平 采用Trizol試劑盒(Invitrogen,CA,USA)提取細(xì)胞或組織中的總RNA;采用Nano Drop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)測(cè)定RNA濃度。使用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara，Japan)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR?Green Real-time PCR-Msater Mix(Toyobo，Japan)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)褪黑素受體1B基因(MTNR1B)和鐵死亡通路相關(guān)基因長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶4(ACSL4)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)及鐵蛋白重鏈1(FTH1)mRNA水平，以GADPH作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃孵育15s、60℃孵育60s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。目的基因的引物序列,見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠胰腺組織中鐵死亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將胰腺組織在含有蛋白酶抑制劑PMSF的裂解緩沖液中裂解，4℃ 13000r/min離心15min。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清中蛋白濃度。將蛋白裂解液與Laemmli樣品緩沖液混合，95℃ 煮沸變性5min。取20μg蛋白樣品，用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。置5%脫脂乳中常溫封閉2h，4℃下與特異性一抗孵育過(guò)夜。一抗包括：兔抗-MTNR1B抗體(1∶1000)、兔抗-ACSL4抗體(1∶1000)、兔抗-GPX4抗體(1∶1000)、兔抗-FTH1抗體(1∶1000)、兔抗-GAPDH抗體(1∶1000)。將膜與對(duì)應(yīng)的二抗常溫孵育2h，通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光和暴露顯影后，利用image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素對(duì)GDM大鼠胰腺組織損傷和細(xì)胞凋亡的影響 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GDM模型組大鼠的胰島形態(tài)不規(guī)則，胰島與外分泌腺界限模糊，胰島細(xì)胞胞漿數(shù)減少，部分胰島細(xì)胞胞漿空泡變性;低濃度褪黑素治療即可有效改善因GDM引起的胰腺組織損傷，GDM+LM組大鼠的胰島形態(tài)趨于規(guī)則;高濃度褪黑素則表現(xiàn)出更加明顯改善作用，GDM+HM組大鼠的胰島形態(tài)規(guī)則，與外分泌腺界限清晰，胰島細(xì)胞胞漿數(shù)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異(圖1)。TUNEL染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GDM組大鼠的胰腺組織細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，而褪黑素治療顯著降低了GDM模型大鼠胰腺組織細(xì)胞的凋亡水平，且高濃度褪黑素表現(xiàn)出更加明顯的治療效果(圖2)。

圖1 大鼠胰腺組織蘇木精-伊紅(HE)染色分析(A～D:×100，bar=50μm;E～H:×200，bar=100μm)A、E:Control;B、F:GDM組;C、G:GDM+LM組;D、H:GDM+HM組。黑色箭頭所指為胰島

圖2 大鼠胰腺組織細(xì)胞Tunel染色分析(Bar=20μm)

2.2 褪黑素對(duì)GDM大鼠血清葡萄糖、糖化血紅蛋白及胰島素水平的影響 與對(duì)照組相比，GDM組大鼠血清葡萄糖、糖化血紅蛋白及胰島素水平均顯著升高;褪黑素治療后GDM組大鼠血清葡萄糖和糖化血紅蛋白水平顯著降低，胰島素水平得到恢復(fù)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠血清生化指標(biāo)

2.3 褪黑素對(duì)GDM大鼠胰腺組織中氧化還原水平及鐵含量的影響 與對(duì)照組相比，GDM組大鼠胰腺組織中H2O2、MDA及鐵含量顯著增加，而CAT、GSH-PX、SOD及GSH水平顯著降低;褪黑素顯著降低了GDM大鼠胰腺組織中H2O2、MDA及鐵含量水平，增加了CAT、GSH-PX、SOD及GSH的水平。見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠胰腺組織生化指標(biāo)分析A：過(guò)氧化氫(H2O2)含量;B：丙二醛(MDA)含量;C：谷胱甘肽(GSH)含量;D：鐵[Fe(II+III)]含量;E：過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，每毫克組織的蛋白每秒鐘催化1μmol H2O2的量為一個(gè)活力單位;F：超氧化物歧化酶(SOD)活性，在反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位;G：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性，每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個(gè)酶活力單位。**P<0.01 vs 正常妊娠組;##P<0.01 vs GDM組

2.4 褪黑素對(duì)GDM大鼠胰腺組織中褪黑素受體及鐵死亡通路相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，GDM組大鼠胰腺組織中MTNR1B、GPX4及FTH1的mRNA和蛋白水平均顯著降低，而ACSL4表達(dá)水平顯著升高;褪黑素顯著增加了胰腺組織中MTNR1B、GPX4及FTH1的mRNA和蛋白水平，降低了ACSL4表達(dá)水平(圖4和圖5)。

圖4 相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平分析**P<0.01 vs 正常妊娠組;##P<0.01 vs GDM組

圖5 Western blot檢測(cè)MTNR1B、ACSL4、GPX4、FTH1蛋白表達(dá)**P<0.01 vs 正常妊娠組;##P<0.01 vs GDM模型組

3 討 論

目前，約有10%的妊娠受到GDM的影響，導(dǎo)致產(chǎn)婦糖尿病癥狀和胎兒發(fā)育異常。有報(bào)道顯示，患有GDM的女性妊娠期間患妊娠高血壓和先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)增加，妊娠后患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)極高[14]，患者出生后的孩子更有可能存在先天缺陷，且患兒童肥胖癥的風(fēng)險(xiǎn)更高[15]。有證據(jù)表明，糖尿病患者血液中褪黑素水平低于健康人[16]。與老年人或患有慢性代謝疾病者一樣，褪黑素減少可誘導(dǎo)胰島素抵抗、葡萄糖耐受不良、睡眠障礙和代謝晝夜節(jié)律紊亂。褪黑素被稱為葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)劑，在其藥理劑量下，褪黑素增強(qiáng)二甲雙胍對(duì)胰島素敏感性和體重增加的作用，并且當(dāng)與二甲雙胍聯(lián)合給藥時(shí)，其表現(xiàn)出治療與肥胖相關(guān)的糖尿病的雙重治療特性[17]。此外，據(jù)研究顯示，孕產(chǎn)婦血清血紅蛋白濃度的升高可能增加患GDM的風(fēng)險(xiǎn)[18]。本研究通過(guò)構(gòu)建雌性大鼠GDM模型，并給予褪黑素治療14天后發(fā)現(xiàn)，褪黑素顯著緩解了GDM大鼠的胰腺損傷和細(xì)胞凋亡情況;血清生化指標(biāo)顯示褪黑素治療顯著降低了GDM大鼠血液葡萄糖、糖化血紅蛋白的水平，同時(shí)恢復(fù)了胰島素水平。以上結(jié)果提示，褪黑素對(duì)GDM大鼠具有治療作用。

氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致高血糖的潛在途徑。氧化應(yīng)激與胰島素抵抗之間存在密切關(guān)系，增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物和減少抗氧化劑可能導(dǎo)致ROS的過(guò)量產(chǎn)生，從而直接損害β細(xì)胞[19]。此外，氧化應(yīng)激還破壞胎盤組織平衡和脂質(zhì)代謝[20]。MDA和SOD是氧化應(yīng)激損傷最重要的參數(shù)[21]。本研究結(jié)果顯示，GDM大鼠胰腺中H2O2、MDA、CAT、GSH-PX、SOD、GSH水平顯著高于對(duì)照組，與之前的研究報(bào)道一致;褪黑素顯著緩解了GDM大鼠胰腺組織的氧化應(yīng)激水平。該結(jié)果提示，褪黑素可能通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，緩解GDM大鼠病理?yè)p傷。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，與鐵相關(guān)的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致脂質(zhì)氧化，從而產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞死亡，如凋亡、壞死、鐵死亡和自噬[22-23]。目前已有證據(jù)證實(shí)，鐵死亡是由Fenton反應(yīng)引發(fā)的羥基自由基產(chǎn)生和酶脂氧合酶機(jī)制引起的鐵催化脂質(zhì)過(guò)氧化積累驅(qū)動(dòng)觸發(fā)的[24]。鐵超載與糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大多數(shù)研究認(rèn)為，鐵超載會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，引起胰島素抵抗，從而增加患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[25]。糖尿病的發(fā)展也會(huì)促進(jìn)鐵的沉積，導(dǎo)致鐵蛋白的增加。鐵蛋白是鐵儲(chǔ)備的指標(biāo)，鐵蛋白的增加與糖耐量異常有關(guān)，這提示過(guò)量的鐵儲(chǔ)存可促進(jìn)GDM的發(fā)病[26-27]。本研究結(jié)果顯示，GDM大鼠胰腺組織中抑制鐵死亡相關(guān)基因GPX4、FTH1的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而促進(jìn)鐵死亡相關(guān)基因ACSL4的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組;經(jīng)褪黑素治療后，GPX4、FTH1的基因表達(dá)水平明顯升高，而ACSL4表達(dá)水平顯著降低。此外，本研究結(jié)果顯示，褪黑素處理后，褪黑素受體基因MTNR1B表達(dá)水平明顯提高，表明褪黑素可能通過(guò)調(diào)節(jié)受體基因及鐵死亡信號(hào)通路基因的表達(dá)，下調(diào)胰腺組織的鐵含量水平，降低組織氧化應(yīng)激水平，從而緩解GDM病理?yè)p傷。

綜上所述，GDM大鼠胰腺組織呈明顯的形態(tài)學(xué)損傷和細(xì)胞凋亡，同時(shí)誘導(dǎo)了明顯的氧化應(yīng)激和鐵超載;褪黑素治療能顯著減弱胰腺組織氧化應(yīng)激水平和鐵超載情況，緩解組織形態(tài)學(xué)損傷和凋亡水平，同時(shí)降低了血清葡萄糖、糖化血紅蛋白水平，并恢復(fù)了胰島素的水平。褪黑素可能通過(guò)抑制機(jī)體氧化應(yīng)激和鐵死亡信號(hào)，緩解GDM病理?yè)p傷。