孫國(guó)勝 楊 宇 許可翠 張昌偉 戴忠良 孫春青 馬志虎,*

(1 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

辣椒(CapsicumannuumL.)常規(guī)雜交育種已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但由于難以獲得穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，辣椒的轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展緩慢[1]。已有報(bào)道中，辣椒主要依靠農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法等構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，例如，使用子葉[2]、下胚軸[3]、Flamingo-bill外植體[4]等作為外植體，試圖建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，但是建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定，或需要特定的材料才能獲得再生體系。辣椒遺傳轉(zhuǎn)化中，采用易獲得再生植株基因型的材料是成功的關(guān)鍵。目前尚缺乏有效的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，尤其是開(kāi)發(fā)一套可操作性強(qiáng)、廣譜性強(qiáng)、效率高的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用尤為重要。

植物花粉納米磁性顆粒轉(zhuǎn)化法是一種磁性納米載體介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因方法，通過(guò)靜電作用，將磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)ployMAG與載有目的基因的外源DNA結(jié)合，形成基因-納米磁顆粒載體復(fù)合物，在強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下，增加納米磁性顆粒與花粉細(xì)胞的接觸面積[5]，加速?gòu)?fù)合物通過(guò)花粉孔[6]傳遞至懸浮于辣椒花粉培養(yǎng)基的花粉中，經(jīng)過(guò)人工授粉，通過(guò)花粉管通道[7]，得到轉(zhuǎn)基因種子，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化T0代植株并將目的基因整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)外源目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化，不需要再組織培養(yǎng)[8-9]。植物花粉納米磁性顆粒轉(zhuǎn)化法屬于載體轉(zhuǎn)化法中的非病毒載體轉(zhuǎn)化方法[10-12]，克服了病毒載體無(wú)法運(yùn)輸大片段基因的局限性[13]，具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)免疫活性[14]、目的基因不受體細(xì)胞內(nèi)酶解影響[12,15]等特點(diǎn)。針對(duì)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化中效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、受物種及基因型限制[16]，尤其在辣椒中難以建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系等問(wèn)題[17]，本研究無(wú)需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，直接采用植物花粉納米磁性顆粒轉(zhuǎn)化法對(duì)辣椒進(jìn)行基因的遺傳轉(zhuǎn)化，旨在為辣椒轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用推廣奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受體為辣椒B2(來(lái)源于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所)，種植于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香創(chuàng)新中心溫室大棚。載體為pCas9-TPC(質(zhì)粒編號(hào)：CD3-1927)(圖1)，購(gòu)自美國(guó)Tair公司，為除草劑(草銨膦)抗性。磁性納米載體為ployMAG(美國(guó)Chemicell公司)，磁板為MagnetoFACTOR plate24(美國(guó)Chemicell公司)。

圖1 pCas9-TPC載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 花粉磁轉(zhuǎn)化與授粉

于2018年4月的晴天上午10:00左右收集辣椒花粉，選擇花藥成熟但還未散粉的花朵進(jìn)行采粉，將24孔培養(yǎng)皿放置于花朵下，輕拍花朵使其花粉散落在培養(yǎng)皿孔中，花粉鋪滿每個(gè)孔孔底，立即加入300 mL的液體花粉培養(yǎng)基，使花粉懸浮在培養(yǎng)基中。100 mL花粉培養(yǎng)基配方為：15%蔗糖+10 mg H3BO3+5.3 mg KNO3+10.3 mg Ca(NO3)2+51.7 mg MnSO4+10.3 mg MgSO4·7H2O+3.0 mg 赤霉素。

將磁性納米顆粒ployMAG與載體質(zhì)粒DNA (1 000 ng·μL-1)按質(zhì)量比1∶1連接，即體系中含有1 μL (濃度為l μg·μL-1)磁性納米顆粒和1 μL(濃度1 μg·μL-1)質(zhì)粒DNA，室溫連接30 min。將連接好的ployMAG/DNA復(fù)合物加入帶有花粉的培養(yǎng)基中，置于MagnetoFACTOR plate24磁板下室溫放置30 min，然后吸去上層液體，將轉(zhuǎn)化的花粉吸至濾紙上，室溫靜置晾干。隨后立刻授粉，并做好標(biāo)記，將剩余轉(zhuǎn)化花粉放置在4℃冰箱，下午15:00點(diǎn)以后重復(fù)授粉1次。

1.3 轉(zhuǎn)化苗的抗性篩選

辣椒自然成熟后收獲種子，隨機(jī)取轉(zhuǎn)化種子若干，播種后待長(zhǎng)出第4片真葉時(shí)進(jìn)行草銨膦抗性鑒定。草銨膦的使用濃度為0.2%，每10 d噴一次草銨膦，共計(jì)噴施3次，鑒定陽(yáng)性植株。播種未轉(zhuǎn)化辣椒為對(duì)照，用清水做同樣處理。

1.4 轉(zhuǎn)化苗PCR鑒定

隨機(jī)選取草銨膦鑒定呈陽(yáng)性的3株T0代植株提取DNA，隨機(jī)選取5株草銨膦鑒定呈陽(yáng)性的5株T0代植株提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，未轉(zhuǎn)化植株和清水為陰性對(duì)照，以pCas9-TCP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR鑒定。

隨機(jī)選取21株T2代植株提取DNA，另隨機(jī)選取21株T2代植株提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，對(duì)DNA和cDNA進(jìn)行PCR鑒定，未轉(zhuǎn)化植株和清水為陰性對(duì)照，以pCas9-TCP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，引物為Cas9-F:T G A G A A C A C T C A G C TC C A GA，Cas9-R:G A G A A C A G A G T AA G C C A C GG。

1.5 轉(zhuǎn)化苗Southern雜交鑒定

選取pCas9-TCP質(zhì)粒和隨機(jī)選取8株P(guān)CR鑒定呈陽(yáng)性植株葉片，提取基因組DNA，以未轉(zhuǎn)化植株為對(duì)照，采用HindIII (日本TaKaRa公司)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，回收片段轉(zhuǎn)膜HyBond N+正電荷尼龍膜(美國(guó)Amersham公司)，用地高辛雜交檢測(cè)試劑盒Ⅱ (化學(xué)發(fā)光法) (瑞士Roche公司)進(jìn)行Southern雜交。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化植株抗性鑒定

采用0.2%的草銨膦噴施轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照植株，轉(zhuǎn)化植株共計(jì)146株，噴施3次后，存活93株轉(zhuǎn)化陽(yáng)性T0代(圖2)植株，對(duì)照組全部死亡。納米磁性顆粒介導(dǎo)的辣椒CRISPR/Cas9基因編輯轉(zhuǎn)化效率約為63.70%。

2.2 轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR鑒定

對(duì)隨機(jī)選取的5株草銨膦鑒定呈陽(yáng)性的T0代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)CRISPR/Cas9載體是否存在于T0代植株中，以pCas9-TCP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株和清水為陰性對(duì)照，鑒定結(jié)果如圖3-a。草銨膦鑒定呈陽(yáng)性的植株中均發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9載體序列，與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致，為預(yù)期的1 049 bp，膠回收后測(cè)序結(jié)果顯示，序列為CRISPR/Cas9載體。

注：A: 野生型；B: 轉(zhuǎn)化植株。

對(duì)隨機(jī)選取的5株T0代草銨膦鑒定呈陽(yáng)性植株進(jìn)行cDNA檢測(cè)，結(jié)果顯示5個(gè)樣品中均出現(xiàn)了目標(biāo)條帶(圖3-b)，條帶大小與以載體為模板擴(kuò)增出來(lái)的一致，通過(guò)測(cè)序檢測(cè)，序列同為CRISPR/Cas9載體。

注：a為DNA鑒定，b為cDNA鑒定；M: DL 2 000標(biāo)記; 1和A: 陽(yáng)性質(zhì)粒；2和B: 水；3和C: 野生型DNA；4～8: 陽(yáng)性植株DNA；D～H: 陽(yáng)性植株cDNA。

對(duì)隨機(jī)選取的21株T2代植株的DNA進(jìn)行PCR鑒定結(jié)果顯示，有16株擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照一致的目的片段(圖4)，隨機(jī)選取2條進(jìn)行膠回收，測(cè)序序列結(jié)果為CRISPR/Cas9載體，為陽(yáng)性植株。

2.3 轉(zhuǎn)化植株Southern雜交鑒定

對(duì)8株鑒定為陽(yáng)性的植株進(jìn)行Southern雜交鑒定結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和8個(gè)陽(yáng)性植株中都隨機(jī)出現(xiàn)了1～3條條帶，陰性對(duì)照上未出現(xiàn)條帶(圖5)。說(shuō)明CRISPR/Cas9載體以1～3個(gè)拷貝整合到了辣椒受體的基因組中。

3 討論

目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系最大的困難就是再生植株獲得困難[1]，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)于轉(zhuǎn)化受體要求較高，不同基因型甚至同一基因型的不同植株的再生能力均存在差異[18-19]，這限制了辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展。本研究采用磁性納米顆粒介導(dǎo)的花粉通道法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，規(guī)避了辣椒植物再生的問(wèn)題。

隨著近些年納米生物學(xué)的發(fā)展，納米顆粒載體被認(rèn)為是一種可有效解決植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)穿透細(xì)胞壁的途徑[20-22]。Kwak等[23]采用單壁碳納米管載體將基因靶向傳遞至葉綠體。良好的納米材料能夠有效地與外源基因結(jié)合，并運(yùn)輸至靶細(xì)胞，前人研究中采用磁性納米顆粒作為基因載體[24-26]，對(duì)外源基因進(jìn)行標(biāo)記、轉(zhuǎn)運(yùn)并在細(xì)胞中得到表達(dá)，說(shuō)明磁性納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是一種非常有效的基因工程手段[27]。在棉花中通過(guò)四氧化三鐵磁性納米顆粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)得到了成功應(yīng)用[28-29]。

注：M: DL 2 000標(biāo)記；1：水；2：野生型；3：陽(yáng)性質(zhì)粒；4～24：T2代植株。

本研究將磁性納米顆粒與辣椒花粉相結(jié)合，在高強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下，利用磁性納米顆粒的強(qiáng)穿透性和高效的運(yùn)載能力，將攜帶外源基因的磁性納米顆粒穿透辣椒花粉孔，將外源基因整合到辣椒花粉中，再通過(guò)人工授粉收獲辣椒種子。本研究采用磁性納米顆粒與外源基因復(fù)合30 min，在磁場(chǎng)作用下整合30 min的方法，獲得了辣椒T0代種子，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化效率約63.70%，轉(zhuǎn)化效率極高，遠(yuǎn)高于基因槍法介導(dǎo)的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化法的4.2%[17]。

注：M: DNA分子量標(biāo)記；C: 陽(yáng)性質(zhì)粒；1～8：陽(yáng)性植株；9：野生型。

此外，運(yùn)用磁性納米顆粒對(duì)辣椒進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，尤其應(yīng)用在辣椒的基因編輯中，對(duì)于辣椒的遺傳育種具有較好的參考作用。此方法的主要特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高，操作簡(jiǎn)單，大田中即可操作，甚至在設(shè)施栽培中，一年可進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化、鑒定，極大地縮短了轉(zhuǎn)化、鑒定的周期；而且此方法還可以批量化、大規(guī)模轉(zhuǎn)化，磁性納米顆粒介導(dǎo)的辣椒基因編輯轉(zhuǎn)化體系成本極低，轉(zhuǎn)化一個(gè)基因的耗材成本約30元。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)磁性納米顆粒介導(dǎo)的辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系，有效解決了辣椒遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)存在的基因型限制、誘導(dǎo)再生困難的問(wèn)題，對(duì)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化、基因編輯研究有重要意義，通過(guò)該體系可以有效進(jìn)行辣椒基因功能研究，并通過(guò)基因工程，培育出更多的辣椒新品種。