蔣維昕，梁馨元，蘭 俊，王建忠，白天道

（1.廣西大學 林學院，廣西 南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)國有東門林場，廣西 崇左 532108）

SSR 表示簡單拷貝序列重復（Simple sequence repeat），又稱為微衛(wèi)星（Microsatellite）DNA 序列，是DNA 在復制或修復過程中DNA 滑動、錯配或不均等交換的結(jié)果，大多數(shù)由1～6 個核苷酸的重復片段串聯(lián)組成長達幾十個核苷酸的單拷貝重復序列，較為均勻的分布在動植物細胞基因組DNA 的編碼和非編碼區(qū)域。SSR 標記是一種以特異性引物擴增核心微衛(wèi)星DNA 的兩端側(cè)翼序列，并利用電泳分析技術(shù)獲得其長度多態(tài)性的分子片段標記技術(shù)。SSR 標記為共顯性標記，與其他分子標記相比，SSR 標記具有擴增穩(wěn)定、數(shù)量豐富、多態(tài)性高以及特異性等優(yōu)勢，已被廣泛應用于群體遺傳學研究、保護遺傳學、分子標記輔助育種以及遺傳圖譜的構(gòu)建等[1]。按其序列來源，SSR 標記可分為基因組SSRs（genomic SSR，簡稱gSSR）和基因表達序列SSRs（EST-SSRs，簡稱eSSRs 或cDNA-SSRs），前者基于基因組DNA序列開發(fā)SSR 標記，后者基于物種基因表達序列（RNA-seq）的開發(fā)[2]。與前者相比，eSSR 標記位于高度保守的物種基因序列的編碼核心區(qū)，因而在近源種屬甚至科間具有較高的通用性[3]。同時，eSSR 標記可通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，也可通過公共基因組數(shù)據(jù)庫中共享的基因表達序列標簽進行引物序列的設計和開發(fā)，較為便捷和高效。另外，隨著功能序列基因組學的發(fā)展，測序成本的大幅度降低，公共數(shù)據(jù)庫中逐日增多的測序數(shù)據(jù)也可推動基因表達功能序列及其他與基因功能相關(guān)的SSR 標記開發(fā)。

大花序桉Eucalyptus cloeziana為桃金娘科Myrtaceae 桉屬Eucalyptus昆士蘭桉亞屬的大型喬木，也叫昆士蘭桉，樹高可達55 m。該樹種天然分布于海拔在25～950 m 之間的澳大利亞昆士蘭州中部和北部區(qū)域（144°44′～152°52′E，15°45′～26°41′S）[4]。以往研究表明，大花序桉材干通直、木材硬度高、尖削度低，木材的花紋美觀、紋理和結(jié)構(gòu)較為均勻，是一種用于制作高檔實木家具的優(yōu)良材料，該種的木材經(jīng)濟價值遠高于短輪伐期的普通桉樹，是極具經(jīng)濟培育價值的中大徑材樹種之一，現(xiàn)已被國家納入珍貴用材樹種的名錄之列，具有非常廣闊的發(fā)展前景[5]。我國對大花序桉的引種工作最早開始于20世紀70年代，廣東、廣西、海南、福建、湖南和四川等省區(qū)陸續(xù)組織開展大花序桉引種與種源選擇試驗。對于大花序桉育種的試驗研究，目前主要集中于引種試驗、種源選擇、家系試驗、木材的材性及其樹木生長特性的關(guān)聯(lián)度等，總體來看，大花序桉在輪伐期具有較強的木材生長潛力和材質(zhì)特性，并且成熟階段材積生長顯著，具體可詳見黃振等[5]的研究綜述。

基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的缺乏，限制了大花序桉遺傳改良的研究，群體遺傳學研究是進行大花序桉分子育種及遺傳資源保護的基本前提[6]。王莉等[7-8]基于近源種巨桉基因組和轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR 標記研究了大花序桉群體遺傳多樣性及其與環(huán)境適應性遺傳變異相關(guān)的序列位點；鄧紫宇等[9]也基于已發(fā)表文獻內(nèi)SSR 位點分析了大花序桉主要分布地區(qū)的群體遺傳變異；類似地，Lyu 等[10]運用近源種桉樹SSR 位點研究了大花序桉不同種源自由授粉子代林遺傳變異水平。在轉(zhuǎn)錄組測序方面，朱林生等[11]首次對大花序桉根系轉(zhuǎn)錄組序列進行基因表達序列及其功能注釋分析。根據(jù)已有的桉屬系統(tǒng)進化分析表明[12]，大花序桉與同屬其他桉樹存在較遠的親緣關(guān)系，為獨立的亞屬分支，因而針對該物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究將有助于進一步探究其遺傳學特性。到目前為止，關(guān)于大花序桉SSR 的分布特征以及EST-SSR 分子標記的開發(fā)相關(guān)研究少見報道。本研究對基于Illumina HiSeq X Ten 高通量測序技術(shù)獲得的大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進行SSR 位點的挖掘，分析和總結(jié)轉(zhuǎn)錄組中SSR 的分布密度和重復基元特征，旨在為大花序桉新的功能基因表達及其相關(guān)的具有豐富多態(tài)性的SSR 標記開發(fā)研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2年生大花序桉主干頂芽，采集自中國廣西崇左市扶綏縣的廣西國有東門林場大花序桉人工引種栽培試驗基地（107°14′108.00″E，22°17′22.30″N）。試驗樣品采集后立刻投入液氮生物速凍箱內(nèi)保存，于2019年10月交由上海歐易生物公司進行樣本RNA 提取、cDNA 文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序，技術(shù)平臺為Illumina HiSeq X Ten高通量測序系統(tǒng)。首先對測序所獲高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組序列進行Trinity 拼接[13]，以獲得Transcript 序列，再根據(jù)序列相似性以及長度，挑選出最長的一條作為Unigene，以此作為后續(xù)研究所用的參考轉(zhuǎn)錄序列。

1.2 試驗方法

采用MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）生物信息學位點分析軟件對大花序桉轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)（Unigenes）進行SSR 位點檢索和分析。SSR 搜索參數(shù)設置標準如下：重復基元1～6 bp，分別代表單核苷酸至六核苷酸，各核苷酸類型最小重復次數(shù)依次分別為10、6、5、5、5 和5 次，轉(zhuǎn)錄組中復合型SSR 的檢索條件是2 個SSR 片段間的距離低于100 bp。

1.3 SSR 引物設計

對含有SSR 且位點上下游序列≥100 bp 的Unigene 序列利用Primer 3 軟件進行引物批量設計。SSR 設計所用參數(shù)設置為：退火溫度（Tm）在58～63℃之間，且上、下游引物之間相差低于5℃；SSR 引物長度為20～27 bp；PCR 產(chǎn)物片段長度在100～280 bp 之間，產(chǎn)物G/C 含量為50%～65%。最后對軟件批量設計的全部SSRs 引物在Unigene 庫中進行blast 驗證。

1.4 SSR-PCR 有效性驗證

隨機挑選24 對引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。大花序桉葉片基因組DNA提取試劑盒及PCR Mix 均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。PCR 擴增程序為：95℃預變性6 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5 min，最后4℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行初步篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花序桉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點的數(shù)量

對大花序桉頂芽進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過組裝共獲得26 587 條去冗余Unigenes，總長度為34 023.022 kb，序列長度在301～15 778 bp 之間，Unigenes 的平均長度為1 279 bp，N50 為1 851，G+C 含量為49.97%。大花序桉全部Unigene序列共檢測出12 366 個SSR 位點，出現(xiàn)頻率為46.51%，分布于8 218 條Unigenes 上（占總Unigene 序列數(shù)的30.91%）。其中，含有2 個或以上SSR 位點的Unigene 序列為2 727 條，含有復合型SSR 位點的Unigene 序列共計1 726 條。在大花序桉轉(zhuǎn)錄組序列中，平均每2.75 kb 序列就會出現(xiàn)1 個SSR 位點（表1）。

表1 大花序桉轉(zhuǎn)錄組中SSR 基本信息Table 1 Basic SSR results in transcriptome of Eucalyptus cloeziana

2.2 大花序桉轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點的重復基元類型及比例

大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 基元種類較為豐富（表2），單核苷酸至六核苷酸重復基元類型均有分布，不同基元重復類型的SSR 數(shù)量差異較大，以單、二、三核苷酸的重復基元類型較多。其中，數(shù)量最多的二核苷酸（5 763 個SSR 位點）和三核苷酸重復（4 229 個SSR 位點）分別占總轉(zhuǎn)錄組總SSR 重復數(shù)量的46.6%和34.20%；其次為單核苷酸類型，占轉(zhuǎn)錄組SSR 數(shù)量的16.70%（共2 065 個SSR 位點）；其余四、五、六核苷酸的重復類型所占比例均相對較低，三者的比例含量總和為2.5%（共309 個SSR 位點）?？傮w來看，含SSR 位點的序列數(shù)量隨核苷酸基元堿基數(shù)的增加逐漸減小。其中，二核苷酸重復類型SSR 的平均分布距離最小，為5.9 kb；而五核苷酸的平均分布距離是前者的122.69 倍，高達723.89 kb。

表2 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 中重復基元類型及數(shù)量Table 2 Type and repeat motifs of SSR loci in Eucalyptus cloeziana transcriptome

2.3 大花序桉轉(zhuǎn)錄組中SSR 重復基元堿基構(gòu)成

大花序桉轉(zhuǎn)錄組12 366 個SSR 位點中，共發(fā)現(xiàn)了116 種重復基元類型，單至六核苷酸重復基元分別為2、4、10、24、25 和51 種（圖1）。在所有核苷酸重復類型中，二核苷酸基元重復類型中以AG/CT 占絕對優(yōu)勢（共5 557 個，占44.94%）；其次為單核苷酸重復基元中A/T 優(yōu)勢基元類型（共1 984 個，占總SSR 的16.04%）；三核苷酸基元類型中，優(yōu)勢重復基元依次為：CCG/CGG（共1 550個，占12.53%），其次為AGG/CCT（共947個，占7.66%），AAG/CTT（共699 個，占5.65%）；大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 中四、五、六核苷酸重復基元雖然類型也較豐富，但所占總SSR 位點比例較低（三者共309 個，僅占2.5%）（圖1），并且其中50 種基元類型僅出現(xiàn)1 次。

圖1 大花序桉轉(zhuǎn)錄組中不同重復基元下SSRs 分布Fig.1 Distribution of different SSR motifs in Eucalyptus cloeziana transcriptome

2.4 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 多態(tài)性潛力分析

2.4.1 大花序桉轉(zhuǎn)錄組序列中SSR 基元重復次數(shù)分布

從大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 位點重復次數(shù)分析來看（表3和圖2），各類型核苷酸重復基元的數(shù)量和比例隨著基元重復次數(shù)的增加而逐漸降低。大花序桉轉(zhuǎn)錄組不同SSR 重復單元重復次數(shù)主要集中于5～20 之間，占總SSR 的98.64%（表3）。其中，低重復次數(shù)（5～10 次）的SSR 位點數(shù)共8 815 個（71.28%）；中度重復次數(shù)中，11～15和16～20 次重復的SSR 位點分別為2 656 個（占SSR 總數(shù)的21.48%）和727 個（占SSR 總數(shù)的5.88%）。大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組SSR 全部重復類型中，占比例最高的依次為5 次、6 次、7 次和10次重復類型，分別為2 007、2 185、1 538 和1 252個，各占SSR 總數(shù)的16.20%、17.70%、12.40%和10.10%。

2.4.2 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 重復片段長度

大量研究發(fā)現(xiàn)，SSR 序列長度≥20 bp 時具有較高多態(tài)性，是理想的標記位點；序列長度在12～20 bp 之間時標記的多態(tài)性適中；＜12 bp 時SSR 標記的多態(tài)性表現(xiàn)極低[14]。因此，本研究選取≥12 bp 的二至六核苷酸重復基元作進一步長度分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR長度多數(shù)集中于12～20 bp，共有6 567 個，占SSR 總數(shù)量的63.75%；其次是21～30 bp，共有3 172 個，占總SSR 數(shù)量的30.79%；超過30 bp 以上的SSR 數(shù)量為562 個，僅占總SSR 數(shù)量的5.46%。數(shù)據(jù)顯示，大花序桉SSR 長度主要集中在中等多態(tài)性長度。另外，大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 平均長度為19.7 bp，其中，最長重復片段為三核苷酸類型AGC/CTG（72 bp），出現(xiàn)次數(shù)僅為1。

表3 大花序桉轉(zhuǎn)錄組不同重復次數(shù)的SSR 數(shù)量分布?Table 3 Different repeat types with different repetitions in Eucalyptus cloeziana transcriptome

圖2 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 重復類型統(tǒng)計Fig.2 Different repeat types and their repeat frequency in Eucalyptus cloeziana transcriptome

2.5 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 引物設計及有效性初步分析

對大花序桉12 366 個SSR 位點進行引物設計，結(jié)果顯示，62.19%的SSR 位點（7 690 個）符合引物設計要求。其中單、二、三核苷酸重復類型SSR 位點數(shù)量分別為1 524、2 363 和2 755 個，四、五、六核苷酸重復類型SSR 位點共168 個，以及復合型SSR 位點共880 個。初步統(tǒng)計，符合引物設計參數(shù)且引物片段長度≥20 bp 的低重復基元類型（二三核苷酸重復）SSR 序列共1 993 個，對這部分序列進行primer 3 引物設計。隨機篩選并合成SSR 引物24 對，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳擴增檢測。參照目的片段大小，共14 對引物能擴增出清晰條帶，擴增效率為58.33%；10 對SSR 引物無法擴增出有效條帶（包括無條帶，條帶較弱，或者產(chǎn)物大小與目的片段大小不符合的類型）占驗證引物總數(shù)的41.67%。1～24 號SSR 引物擴增情況如圖4所示。

圖3 大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 基元長度分布Fig.3 Distribution of SSR length in Eucalyptus cloeziana transcriptome

3 討 論

本研究基于Illumina HiSeq X Ten 高通量測序分析所獲大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并進行SSR分布及其序列結(jié)構(gòu)特征分析，從全部26 587 條Unigenes序列中檢測到單至六核苷酸重復類型共計12 366 個SSR 位點，平均每2.75 kb 出現(xiàn)1 個SSR位點，SSR 位點的發(fā)生頻率約為46.51%。大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 位點的分布密度與早期Ceresini 等[15]基于全forests 公共資源數(shù)據(jù)庫下載近源種桉樹（E.grandis,E.globosus,E.saligna和E.urophylla）71 115 條EST 序列的分析結(jié)果一致：對轉(zhuǎn)錄組采用相同的搜索標準（單～六核苷酸基元類型）可獲得20 530 個SSR 位點，SSR 位點間平均分布距離約為2.7 kb（SSR 發(fā)生頻率約為29%）；大花序桉SSR 分布頻率高于He 等[16]報道的幾種桉樹每3.7 kb 出現(xiàn)1 個SSR 位點以及藍桉（E.globulus）[17]轉(zhuǎn)錄組SSR 出現(xiàn)頻率約為23.15%；但也低于茶樹（平均每2.61 kb 出現(xiàn)1 個SSR 位點）[18]、橡膠樹（平均每2.25 kb 出現(xiàn)1 個SSR 位點，SSR 發(fā)生的頻率約為63.71%）[19]及天竺桂（60.83%）[20]轉(zhuǎn)錄組中SSR 序列的平均分布頻度。大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組中二至六核苷酸基元類型SSR 平均分布距離為3.30 kb （SSR 發(fā)生頻率為38.74%），仍遠高于采用相同搜索標準（二至六核苷酸）下大花序桉根部轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的SSR 分布密度（平均每3.57 kb出現(xiàn)1 個SSR 位點，SSR 發(fā)生頻率為24.87%）[11]。相比以往的報道，本研究獲得的大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組SSR 位點發(fā)生頻度較大，可能與較長的轉(zhuǎn)錄組Unigene 序列有關(guān)（平均長度為1 279 bp）。朱林生等[11]和Ceresini 等[15]研究獲得的大花序桉根部及近源種桉樹轉(zhuǎn)錄組Unigene 序列平均長度分別為890 和732 bp。Varshney 等[21]認為，即便運用相同方法進行SSR 分析，所獲得的SSR 分布頻度也會出現(xiàn)差異，除了物種間差異因素，還與測序數(shù)據(jù)深度、序列拼接數(shù)據(jù)質(zhì)量及SSR 位點查找軟件以及SSR 搜索標準不完全相同等原因有關(guān)。

大花序桉轉(zhuǎn)錄組所有SSR 基元類型中，二、三核苷酸重復為主要基元類型，分別占大花序桉轉(zhuǎn)錄組總SSR 數(shù)量的46.60%和34.20%，與絕大多數(shù)植物中SSR 分布特征一致。二核苷酸基元類型在絕大多數(shù)已報道植物中均以AG/CT 重復基元類型為主，本試驗中，大花序桉轉(zhuǎn)錄組中AG/CT 也明顯占據(jù)絕對優(yōu)勢（44.94%）。三核苷酸優(yōu)勢基元的類型則在不同的物種中含量差別較大，大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組SSR 中三核苷酸類型的優(yōu)勢基元為CCG/CGG（12.53%），與同種根部組織[11]以及近源種桉樹E.grandis、E.urophylla、E.globosus、E.saligna和E.camaladulensis及部分桃金娘科植物中[2,15,16]中檢測到的結(jié)果吻合。根據(jù)以往報道，CCG/CGG 基序在雙子葉植物中比較罕見，而在禾本科等單子葉植物中含量普遍較高[22]，這可能與具有較高的GC 含量或者某些堿基的偏愛程度有關(guān)。研究表明，大部分雙子葉植物如楠木[23]、龍眼[24]、云南金花茶[25]、楊樹[26]等基因組或轉(zhuǎn)錄中檢測到的三核苷酸基元以CTT/AAG 最為豐富；薄殼山核桃[27]、黑果枸杞[28]等少部分雙子植物中三核苷酸基元則以AAC/GTT 為主。

SSR 標記的多態(tài)性與其基元重復次數(shù)以及序列片段長度密切相關(guān)。以往研究表明，SSR 基元重復的次數(shù)越高，多態(tài)性標記的開發(fā)潛力越大，尤其當基元重復的次數(shù)≥12 次時多態(tài)信息的含量較高[29]。本研究中，大花序桉轉(zhuǎn)錄組不同SSR 重復單元重復次數(shù)主要集中在5～20 之間（約占98.64%），其中，重復次數(shù)≥12 次的比率約為22.52%，表明大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 位點理論上具有較大開發(fā)潛能。本研究中，滿足該引物設計標準的大花序桉SSR 位點共7 690 個，占總SSR 數(shù)的62.19%。由于基元重復的次數(shù)及堿基構(gòu)成的差異直接影響SSR 重復序列的長度，因此SSR 重復序列長度是影響其多態(tài)性高低的決定性因素，序列長度≥20 bp 且為低基序重復單元類型（二、三核苷酸）的轉(zhuǎn)錄組SSR 位點往往呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性[14]。大花序桉轉(zhuǎn)錄組SSR 序列中，符合引物設計標準且重復片段長度≥20 bp 的低重復基元（二、三核苷酸）類型的SSR 位點共有1 993 個，占大花序桉SSR 總數(shù)的16.12%，從中隨機挑選合成的24 對引物經(jīng)PCR 擴增驗證，共14 對引物（58.33%）能高效擴增出預期條帶大小。表明這部分序列具有較大的多態(tài)性標記開發(fā)潛力，其群體檢測水平及通用性評價需做進一步研究。

4 結(jié) 論

基于高通量測序技術(shù)獲得的大花序桉頂芽轉(zhuǎn)錄組SSR 位點發(fā)生頻率高，分布密度大，重復基元類型豐富，設計的引物擴增效率高，具有較高的多態(tài)性標記開發(fā)潛能。依據(jù)本文研究的大花序桉SSR 位點序列進一步開發(fā)出分子標記，可為進一步研究大花序桉及其他桉樹的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及分子標記輔助育種提供有效的理論基礎。