（湖南省森林植物園，湖南 長沙 410116）

黑老虎Kadsura coccinea(Lem.) A.C.Smith 亦稱冷飯團，為五味子科Schisandraceae 南五味子屬常綠木質藤本，天然分布于東南亞以及我國南方地區(qū)。黑老虎用途廣泛，在藥材、食品和園林觀賞方面具有廣闊應用前景。其果實富含人體所需的各種氨基酸和維生素C 等營養(yǎng)物質[1]，且香甜可口，風味獨特，作為一種新奇水果，在我國水果市場頗受青睞[2]。黑老虎根和莖富含木脂素和三萜類活性成分[3-4]，其提取物具有顯著的美白護膚功效[5]；其根亦為一種傳統(tǒng)中藥材，具有抗氧化、降血脂、活血化瘀、行氣止痛等功效，可治療風濕性關節(jié)炎、跌打腫痛等病癥[6-7]；黑老虎還具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗HIV 和抗肝纖維化等藥理活性[4]。黑老虎掛果時間長，鮮果顏色多樣、色澤艷麗，果形獨特，亦為優(yōu)良的觀賞植物。

近年來，由于利益驅動，黑老虎野生資源分布地出現(xiàn)掠奪式采果和挖根現(xiàn)象，生境遭受嚴重破壞，黑老虎野生資源急劇減少，導致其種質資源破壞殆盡，對于黑老虎遺傳改良將造成不可挽回的損失[8]，開展黑老虎種質資源保護迫在眉睫。另一方面，目前黑老虎在湖南、貴州和廣西等省區(qū)迅速推廣種植，湖南通道縣種植尤為普遍，該縣黑老虎已成為國家地理標志產品和支柱產業(yè)[9]。然而生產上缺乏良種，目前普遍采用挖取野生苗或隨意采種育苗，良種選育研究才開始起步。簡單重復序列（SSR）標記具有信息含量高、重復性好、操作簡單、成本較低，而且為共顯性，為學者們廣泛應用[10-12]。本研究首次開發(fā)黑老虎SSR標記，旨在為其群體遺傳學研究、種質資源收集、保存與評價以及育種計劃制定等奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

在湖南共收集到黑老虎及其近緣種91 個植株的嫩葉（表1），包括會同、城步和桂東天然群體的66 個黑老虎植株，南岳樹木園10 個南五味子K.longipedunculata植株，南岳林場4 個異形南五味子K.heteroclita、4 個翼梗五味子Schisandra henryi、5 個華中五味子S.sphenanthera和2 個狹葉五味子S.lancifolia等15 個植株。采樣植株間的距離在30 m 以上。嫩葉采用硅膠干燥，應用改良的CTAB 法提取其DNA[13]。

表1 用于SSR 標記開發(fā)的南五味子屬和五味子屬樣品信息?Table 1 Information of all Kadsura and Schisandra samples for SSR markers development

1.2 高通量測序

從湖南省城步群體選取1 個黑老虎植株的總DNA 用于SSR 位點搜索。利用DNA 片段化試劑盒AIRTMDNA Fragmentation Kit （Bioo Scientific Corp.,Austin,USA）將其總DNA 打斷。經切膠純化，選取其中300～500 bp 的片段，應用高通量快速建庫試劑盒NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific Corp.,Austin,USA） 建庫。利用Illumina HiSeq 2000 PE 150 平臺（Illumina,San Diego,USA）進行高通量測序。獲得下機序列后，應用Trimmomatic 軟件[14]對其進行質量控制，刪除其中Q20＜90%和正反向序列不匹配比率高于10%的序列。應用SPAdes 3.9.0 軟件[15]對序列進行基因組拼接，參數(shù)選擇默認值。

1.3 SSR 挖掘與引物設計

應用軟件MISA[16]（http://pjrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對拼接好的序列進行SSR 位點搜索，其參數(shù)設置如下：重復單元樣式為單、二、三、四、五和六核苷酸重復，其最小重復次數(shù)分別為10、5、4、3、3 和3；復合位點的重復單元間序列堿基數(shù)不超過20。獲得含有SSR 位點的序列后，應用軟件Primer 3[17]（http://fokker.wi.mit.edu/primer3/）設計引物，參數(shù)設置為默認值。

1.4 引物篩選與位點多態(tài)性檢測

從會同、城步和桂東群體各選取1 個DNA樣品對設計的引物進行PCR 擴增，確定實驗體系并檢測引物的可用性。為了方便后續(xù)位點多態(tài)性檢測，選擇單元重復數(shù)不小于7 的SSR 位點合成160 對引物，并在其正向引物的5′端增加一段M13 序列（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）。PCR 擴增反應采用10 μL 體系，具體包括：50 ng DNA 模板、150 μM dNTPs、2.0 μM MgCl2、0.5 μM M13 標記正向引物、0.5 μM 反向引物、1×PCR 緩沖液（天根生化科技有限公司，北京）和0.04 U/μL Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限公司，北京）。擴增反應在PCR 擴增儀Master cycler Gradient Thermal Cycler （Eppendorf）上 進行，其程序為：94℃預變性 4 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min；最終產物保存于4℃冰箱。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇給定片段長度位置具有清晰且單一條帶的引物，用于后續(xù)位點多態(tài)性檢測。

選取會同、城步、桂東群體的66 個DNA 樣品，應用M13-tailed 引物法[18]進行SSR 位點多態(tài)性檢測。其PCR 擴增反應采用10 μL 體系，具體包括：50 ng DNA 模板、150 μM dNTPs、2.0 μM MgCl2、0.5 μM 熒光標記的M13 引物、0.5 μM M13 標記的正向引物、0.5 μM 反向引物、1×PCR 緩沖液（天根生化科技有限公司，北京）和0.04 U/μL Taq DNA 聚合酶（天根生化科技有限公司，北京）。擴增反應程序與前面部分相同。

采用3730 XL自動測序儀（Applied Biosystems，USA 檢測PCR 產物，選用內標為GeneScan 500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems，USA）。使用軟件GeneMarker V2.2.0[19]判讀基因型。進一步選取5 個近緣種的25 個DNA 樣品（表1）開展引物通用性檢測。

1.5 遺傳多樣性分析

應用MICRO-CHECKER 2.2.3 軟件[20]檢測和修正啞等位基因；應用POPGENE version 1.31 軟件[21]計算每位點等位基因數(shù)（A）、實際雜合度（Ho）和期望雜合度（He），檢測位點是否偏離Hardy-Weinberg 平衡（HWE）以及是否存在連鎖不平衡現(xiàn)象（LD）。

2 結果與分析

2.1 基因組SSR 位點的分布特征

通過序列質量控制和拼接組裝獲取687 805條unigene，其中，82 454 條含有SSR；61 032 條可用于設計PCR 引物，其預期產物片段大小為100～280 bp。SSR 重復長度為10～100 bp，其平均長度為14 bp。共獲得152 207 個候選SSR 位點，其中，二核苷酸重復比率最大（57.68%），其次為單核苷酸重復（17.30%）和四核苷酸重復（10.6%），三核苷酸重復、五核苷酸重復和六核苷酸重復的比率低得多，3 者總和為14.32%（表2）。在檢測到的序列中，單、二、三、四、五和六核苷酸重復的SSR 位點間平均距離分別7.67、2.30、17.12、12.43、41.41 和39.48 kb。

分析SSR 重復單元類型可以看出，單核苷酸重復單元（motif）中，A/T 最為普遍，占98.06%，C/G 僅為1.94%（圖1a）；二核苷酸重復單元以AC/GT（57.30%）最為普遍，其它依次為AG/CT（36.57%）、AT/AT（6.04%） 和CG/CG（0.09%）（圖1b）；三核苷酸重復單元有10個類型，以AAG/CTT 最普遍（41.91%），ACG/CGT 最少（0.34%）（圖1c）；AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT 和ACACAT/ATGTGT 分別是四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復單元中最普遍的，其比率為29.55%、29.18%和40.31%（圖1d—f）。

2.2 SSR 位點的多態(tài)性分析和種間應用

引物篩選結果表明，參與測試的160對引物中，有102 對能夠清晰擴增出預期大小的特異片段（clear specific amplicons）；其中40 個位點具多態(tài)性。而40 個位點中，有12 個位點出現(xiàn)多個片段，難以判讀，因此，成功篩選出28 個多態(tài)性位點（表3）。應用3 個天然群體對28 個位點進行遺傳多樣性分析可知，每位點等位基因數(shù)（A）為2～14，共計168 個等位基因，實際雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為 0.000～0.900 和0.000～0.860（表4）。其中9 個位點可能含有啞基因（95%置信區(qū)間）；對啞基因進行修訂（correction）后發(fā)現(xiàn)，城步、桂東和會同群體分別有13、7 和9 個位點顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。28 個位點的所有成對分析中，均未發(fā)現(xiàn)顯著連鎖不平衡現(xiàn)象（P≥0.05）。

表2 黑老虎基因組SSR 的分布特征Table 2 Distribution of SSRs in the genome of Kadsura coccinea

表3 黑老虎28 個SSR 多態(tài)位點的特性?Table 3 Characterization of 28 polymorphic SSR loci for Kadsura coccinea.

表4 28 個SSR 位點在3 個黑老虎群體的遺傳多樣性數(shù)據?Table 4 Genetic diversity data of 28 polymorphic SSR loci in three Kadsura coccinea populations

28 對引物的通用性因植物種類而異。對于南五味子屬，有24 對引物可應用于南五味子，14 對引物用于異形南五味子，分別占85.71%和50%；相比而言，28 對引物在五味子屬中的通用性低得多，僅6、9、7 對引物分別在翼梗五味子、華中五味子和狹葉五味子獲得成功擴增，分別占21.43%、32.14%和25.00%（表5）。從表5還可以看出，有KCZ031、KCZ036、KCZ045、KCZ053、KCZ058、KCZ073、KCZ100、KCZ103、KCZ122、KCZ127、KCZ128、KCZ136、KCZ146、KCZ147 等14 對引物在南五味子屬的2 個種均能成功擴增；僅引物KCZ147能成功應用于南五味子屬和五味子屬的5 個種，說明該引物的通用性最佳。

3 結論和討論

3.1 黑老虎基因組SSR 的特征

本研究通過Illumina高通量測序檢索到152 207個候選SSR 位點，以二核苷酸重復的比例最大，占57.69%，AC/GT 基元占二核苷酸重復總數(shù)的57.30%；單核苷酸和和四核苷酸重復的比例分別為17.30% 和10.68%，以A/T 和AAAT/ATTT 基元為主，占比為98.06%和29.55%。楊梅Myrica rubar基因組中，二核苷酸重復的占比高達82.99%，其中AG/CT 基元出現(xiàn)頻率高達55.70%，本研究與之基本一致；所不同的是，楊梅基因組中二至六核苷酸重復的占比呈明顯下降趨勢[22]，而在本研究中其占比則出現(xiàn)波動。王家等[23]亦采用Illumina 高通量測序開發(fā)山白樹Sinowilsonia henryi的SSR 標記，從7 614 條序列中搜索到694個SSR 位點，以單核苷酸重復最多，占51.78%，重復基元以A/T 最多；其次為二核苷酸重復，占34.01%，以AG/CT 為主；從單核苷酸至六核苷酸重復，其所占比例整體上越來越少，本研究與之差異較大。而橢圓葉花錨Halenia ellipitica則以三核苷酸重復最為豐富，其比例為43.11%，以基元AAT 為主；其次為四、二核苷酸重復，比例分別為29.31%和21.55%，以重復基元AAAT 和AT 為主[24]，本研究亦與之明顯不同。說明SSR 在基因組的特征因植物種類不同而存在明顯差異。

表5 黑老虎28 個SSR 位點在近緣種的應用?Table 5 Allele numbers obtained in cross-amplification trials of 28 SSR loci for relatives of Kadsura coccinea

3.2 黑老虎SSR 標記開發(fā)

開發(fā)SSR 引物有很多種方法，利用高通量測序獲得SSR 位點數(shù)量遠遠高于探針雜交富集等傳統(tǒng)方法。如在五味子科中，Yan 等[25]基于華中五味子的AFLP 片段序列構建富集SSR 基因組文庫，經SSR 探針雜交，獲得61 條含有SSR 的序列，設計50 對引物開發(fā)出9 個多態(tài)性SSR 標記；Sun等[26]基于SSR 探針雜交富集SSR，獲得五味子234 條含SSR 的序列，設計137 對引物開發(fā)出14個多態(tài)性SSR 標記；而在本研究中，應用Illumina高通量測序獲得82 454 條含有SSR 的序列，設計160 對引物，獲得28 個多態(tài)性SSR 標記。在本研究中，我們?yōu)榱颂接懼貜蛦卧獙σ锖Y選效率的影響，設計的160 對引物中，二、三、四、五核苷酸重復各40 對，由表3可以看出，4 種類型分別開發(fā)出14、8、4、2 對引物，其等位基因數(shù)依次為5～14、2～8、3～5、2～3，開發(fā)的引物數(shù)和多態(tài)性均呈下降趨勢。由此可見，引物篩選效率與檢測引物有關，宜選擇二、三核苷酸重復的SSR 位點設計并開發(fā)引物。

本研究開發(fā)出的28 對SSR 引物，分別有24 和14 對可應用于同屬的南五味子和異形南五味子，成功率分別為85.71%和50.00%；而僅有6～9 對引物在五味子屬的翼梗五味子、華中五味子和狹葉五味子得到成功擴增，成功率為21.43%～32.14%。Sun 等[26]亦發(fā)現(xiàn)14 對五味子SSR 引物中有11 對可用于同屬的華中五味子，成功率近80%。石曉蒙等[27]從同屬的無?；礠uercus petraea、蒙古櫟Q.mongolica、夏櫟Q.robur、麻櫟Q.acutissima、遼東櫟Q.liaotungensis5 個種的62 對基因組SSR 和EST-SSR 引物中篩選出41 對可用于栓皮櫟Q.variabilis，成功率達66.13%。說明親緣關系明顯影響引物的種間應用，同屬植物間SSR 引物的通用性要遠高于不同屬。因此，應用別種植物的SSR 引物進行篩選時，盡量選擇親緣關系近的種。一般而言，宜選擇同屬植物，以提高引物篩選效率以及SSR 標記的多態(tài)性。

綜上所述，本研究開發(fā)出28 個多態(tài)位點；通過3 個天然群體的多樣性分析可知，每位點等位基因數(shù)為2～14，實際雜合度和期望雜合度分別為0.000～0.900 和0.000～0.860，說明這些標記具有較高的多態(tài)性，可用于揭示黑老虎群體間和群體內的遺傳多樣性，為我們深入開展黑老虎群體遺傳學研究、種質資源收集、保存和評價以及分子標記輔助育種研究提供了技術支撐。本研究開發(fā)的引物數(shù)量對于基因組關聯(lián)分析等研究而言尚偏少，然而大量SSR 候選位點序列也為我們將來大規(guī)模標記開發(fā)進而為黑老虎基因組關聯(lián)分析、基因組選擇等奠定了基礎。