陳新元，陳 茹，吳海霞，馬桂珍，暴增海

（江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，連云港 222005）

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillusmethyltrophicus是2010年報(bào)道的新種[1]，因其代謝產(chǎn)物的多樣性、對(duì)外界環(huán)境因子的多抗逆性和無(wú)污染無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越多地運(yùn)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[2-5]。許多學(xué)者從不同環(huán)境中分離得到多個(gè)對(duì)多種植物病害具有良好的防治效果并具有促生作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌。采俊香和李月梅[6]從抱緊苦荬菜根部分離到對(duì)番茄早疫病病菌Alternariasolani等植物病原菌具有較好抑菌效果的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌 G-5。殷曉敏等[7]和謝學(xué)文等[8]分別從西瓜和黃瓜的根際土壤分離獲得對(duì)西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum和黃瓜炭疽病菌Colletotrichumlagenarium具有良好防治作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌XG-1和WF-3。黎肇家等[9]從黃柏樹(shù)皮分離到一株對(duì)黃柏苗有顯著促生效果的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌T50。一些菌株目前已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成微生物制劑，用于植物病害的防治[10]；謝學(xué)文等[11]和胡江春等[12]把從黃瓜根際土壤和海泥中得到的兩株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌WF-3和9912分別研制成了微粉劑和可濕性粉劑，用于黃瓜炭疽病和黃瓜灰霉病的防治，具有較好的防治效果。

目前，有關(guān)芽胞桿菌大量制備的方法多為液態(tài)發(fā)酵，與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有培養(yǎng)基原料來(lái)源廣且價(jià)格低、能耗少、技術(shù)較簡(jiǎn)單、產(chǎn)物的產(chǎn)率較高、環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)，在微生物肥料、微生物農(nóng)藥以及飼料的生產(chǎn)中使用愈加廣泛[8,13]。如唐曉星等[14]利用甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NCU507固態(tài)發(fā)酵豆粕獲得蛋白酶，潘韻等[15]利用甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌2-3固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)雞飼料等，而有關(guān)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌生防菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件研究較少。

本實(shí)驗(yàn)室前期從連云港海域中分離得到一株對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌ValsamaliMiyableetYamada、小麥赤霉病菌Fusariumgraminearum、番茄早疫病菌、稻瘟病病菌Pyriculariaoryzae等多種植物病原真菌有良好的抑制作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04，為充分利用農(nóng)產(chǎn)品下腳料，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用菌株研制微生物制劑，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化該菌株的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測(cè)定發(fā)酵物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響，為該菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04由本實(shí)驗(yàn)室在連云港海域中分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)基為PD培養(yǎng)基。

1.2 種子液的制備

菌株BMF 04活化后接種于裝有60 mL PD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，調(diào)整菌液濃度為108細(xì)胞/mL，作為發(fā)酵種子液。

1.3 固態(tài)發(fā)酵初始條件

250 mL三角瓶裝瓶量20%，接種量為培養(yǎng)基質(zhì)量的20%，pH自然，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間3 d。

1.4 細(xì)菌總數(shù)和芽胞率的測(cè)定

不同位置的菌株BMF 04發(fā)酵物混合均勻后，隨機(jī)取10 g加入到裝有90 mL含有0.5%吐溫-80的無(wú)菌水溶液和10個(gè)直徑為0.5 cm的玻璃珠的250 mL三角瓶中，180 r/min充分振蕩30 min為菌懸液，菌懸液梯度稀釋?zhuān)捎醚蛴?jì)數(shù)板法[16]測(cè)定稀釋液中的細(xì)菌總數(shù)，采用結(jié)晶紫染色法[17]測(cè)定芽胞率。

1.5 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 將菌株BMF 04分別接種到8種不同的培養(yǎng)基（表1）中，按1.3條件進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)和芽胞率，選擇細(xì)菌總數(shù)和芽胞率高的培養(yǎng)基作為優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基為一個(gè)處理，每個(gè)處理接種3瓶為3次重復(fù)。

表1 不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方Table 1 Formulation of different solid-state fermentation media

1.5.2 培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗(yàn) 選擇蔗糖、淀粉、麩皮、玉米粉、葡萄糖、玉米芯、菌糠、稻殼粉、米糠分別代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源；按1%質(zhì)量比在培養(yǎng)基中分別加入尿素、硫酸銨、硝酸銨、氯化氨、硝酸鈉為補(bǔ)充氮源；按0.1%質(zhì)量比在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入硫酸鎂、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸亞鐵為補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽；每一因素變化時(shí)其他成分及含量固定不變，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，每種培養(yǎng)基為一處理，每處理接種3瓶，為3次重復(fù)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)和芽胞率，篩選細(xì)菌總數(shù)和芽胞率高的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)。

將篩選出的碳源按培養(yǎng)基質(zhì)量2%、4%、6%、8%、10%；氮源按培養(yǎng)基質(zhì)量0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2%；無(wú)機(jī)鹽按培養(yǎng)基質(zhì)量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每種因素試驗(yàn)其他成分及含量固定不變，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，在基礎(chǔ)發(fā)酵條件下發(fā)酵，每個(gè)變量為一個(gè)處理，每個(gè)處理接種3瓶為3次重復(fù)，測(cè)定不同質(zhì)量比碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵物的細(xì)菌總數(shù)和芽胞率，確定碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的添加質(zhì)量比。

1.5.3 培養(yǎng)基優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)和濃度為基礎(chǔ)，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以細(xì)菌總數(shù)為響應(yīng)值，以碳源含量（A）、氮源含量（B）、無(wú)機(jī)鹽含量（C）為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，測(cè)定不同組合發(fā)酵物中BMF 04菌株的細(xì)菌總數(shù)和芽胞率，分析不同因素和水平對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵的影響及其顯著性。

1.6 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)BMF 04菌株的發(fā)酵時(shí)間、溫度、料水比、接種量、初始pH等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化在1.3初始條件下發(fā)酵，接種后每4 h取樣一次，測(cè)定確定最佳發(fā)酵時(shí)間；發(fā)酵溫度設(shè)為 24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃；料水比設(shè)為 1:0.7、1:1、1:1.3:、1:1.6、1:1.9；接種量設(shè)為質(zhì)量比5%、10%、15%、20%、25%；不同初始pH設(shè)為5、6、7、8、9，以初始發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，每一因素的優(yōu)化均在前一因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行，測(cè)定不同條件下發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)及芽胞率。每個(gè)發(fā)酵條件為一處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.7 優(yōu)化后培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件的細(xì)菌總數(shù)和芽胞產(chǎn)率

將菌株BMF 04分別接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，分別按優(yōu)化前和優(yōu)化后的條件進(jìn)行發(fā)酵，比較優(yōu)化前后發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)和芽胞率。

1.8 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

1.8.1 黃瓜種子處理 黃瓜品種為新津研四號(hào)，購(gòu)于連云港市種子站。用溫湯浸種法對(duì)黃瓜種子進(jìn)行消毒，取出種子置于墊有兩層濕潤(rùn)濾紙片的培養(yǎng)皿中，28 ℃條件下恒溫催芽1 d至種子露白。

1.8.2 土壤處理與播種 將發(fā)酵物與土壤分別按照質(zhì)量比 1:100、1:150、1:200、1:250、1:300混勻，裝入25 cm×14 cm的花盆中（每盆1.5 kg），以空白土壤為對(duì)照，每盆播種15粒催芽后的黃瓜種子，每個(gè)比例為一處理，每個(gè)處理播種4盆。分別于子葉期、一葉期、二葉期、三葉期隨機(jī)取5株幼苗，測(cè)定黃瓜株高和莖粗，于三葉期時(shí)測(cè)定幼苗地上部分與地下部分的鮮重和干重以及須根數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0軟件分析處理，響應(yīng)面設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析由Design-Expert 8.0.6軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 菌株BMF 04在供試的不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中細(xì)菌總數(shù)和芽胞率不同，在培養(yǎng)基1中的細(xì)菌總數(shù)最高，為2.65×1010細(xì)胞/g；而培養(yǎng)基5的芽胞率最高，可達(dá)93%。但培養(yǎng)基5的細(xì)菌總數(shù)為2.47×1010細(xì)胞/g，顯著低于培養(yǎng)基1（P＜0.05）。因此，選擇培養(yǎng)基1作為BMF 04菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（圖1）。

圖1 菌株BMF 04在不同固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況Fig.1 Fermentation of BMF 04 in different solid-state fermentation media

2.1.2 最佳碳源種類(lèi)及含量的確定 不同碳源對(duì)菌株BMF 04細(xì)菌總數(shù)和芽胞率有顯著影響。以菌糠和玉米粉作為碳源的發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)最高，分別為2.76×1010細(xì)胞/g和 2.69×1010細(xì)胞/g，二者差異不顯著（P＞0.05），芽胞率分別為92%和96%（圖2）?？紤]到菌糠成本低于玉米粉，選擇菌糠為BMF 04菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。碳源濃度試驗(yàn)顯示，菌糠含量為8%時(shí)，發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)最高，為 2.94×1010細(xì)胞/g，與其他處理差異顯著（P＜0.05），芽胞率為93%；菌糠的濃度低于或高于8%，細(xì)菌總數(shù)均顯著下降。因此，選擇菌糠含量為8%作為響應(yīng)面試驗(yàn)中間值（圖3）。

圖2 不同碳源對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on solid state fermentation of BMF 04 strain

圖3 碳源濃度對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of carbon source concentration on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.1.3 最佳氮源種類(lèi)及含量的確定 以硝酸銨為氮源的發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)最高，為2.66×1010細(xì)胞/g，顯著高于其他氮源（P＜0.05），芽胞率為89.3%，因此選擇硝酸銨作為BMF 04菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源（圖4）；氮源濃度試驗(yàn)顯示，硝酸銨含量為 0.8%時(shí)，發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)最高，為 2.77×1010細(xì)胞/g，與其他處理差異顯著（P＜0.05），且芽胞率較高，為85%；硝酸銨含量低于或高于0.8%時(shí)，細(xì)菌總數(shù)顯著降低（P＜0.05），因此，將氮源含量0.8%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中間值（圖5）。

圖4 不同氮源對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on solid state fermentation of BMF 04 strain

圖5 氮源濃度對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of nitrogen source concentration on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.1.4 最佳無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及含量的確定 在培養(yǎng)基中分別加入0.1%的不同種類(lèi)無(wú)機(jī)鹽，發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)和芽胞率明顯不同。添加碳酸鈣和氯化鈉發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)顯著高于其他無(wú)機(jī)鹽，分別為2.75×1010細(xì)胞/g和2.74×1010細(xì)胞/g，二者差異不顯著（P＞0.05），但添加氯化鈉的發(fā)酵物中的芽胞率較高，為87%，因此選擇氯化鈉為培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽（圖6）；氯化鈉含量試驗(yàn)顯示，氯化鈉含量為0.2%時(shí)，發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)顯著高于其他含量，為2.98×1010細(xì)胞/g，且芽胞率較高，為84%；氯化鈉濃度高于或低于0.2%，細(xì)菌總數(shù)均顯著降低，因此將氯化鈉含量0.2%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中間值（圖7）。

圖6 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of different inorganic salts on solid state fermentation of strain BMF 04

2.1.5 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)17組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到A、B、C因素與細(xì)菌總數(shù)Y之間的模型回歸方程為Y=-1.42＋0.46A＋6.86B＋10.22C-0.09AB-0.03AC＋0.25BC-0.03A2-4.98B2-25.68C2。

回歸模型的P＜0.0001，失擬項(xiàng)的P值為0.55，模型回歸極顯著，失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，模型穩(wěn)定?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.9890，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合較好。不同因素對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響大小不同，氮源＞碳源＞無(wú)機(jī)鹽，碳源與氮源濃度兩因素之間的交互作用較為顯著。推測(cè)出的極值點(diǎn)為菌糠6.7%，硝酸銨0.6%，氯化鈉0.2%，細(xì)菌總數(shù)預(yù)測(cè)值為3.27×1010細(xì)胞/g（表2）。

表2 菌株BMF 04培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and test results of culture medium optimization of strain BMF 04

為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)的可靠性，采用1.3的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基做3組平行試驗(yàn)，測(cè)得發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)為3.31×1010細(xì)胞/g，芽胞率為90%，與預(yù)計(jì)值3.27×1010細(xì)胞/g差異不顯著（P＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)擬合性較好，說(shuō)明此優(yōu)化結(jié)果有效，得到的優(yōu)化組合可作為菌株固體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基（表3）。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 在8～44 h時(shí)，細(xì)菌總數(shù)快速增加，44 h時(shí)細(xì)菌總數(shù)為3.4×1010細(xì)胞/g為對(duì)數(shù)期，其后細(xì)菌總數(shù)增加緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期，72 h細(xì)菌總數(shù)開(kāi)始下降為3.32×1010細(xì)胞/g，進(jìn)入衰退期。36 h時(shí)開(kāi)始形成芽胞，44 h芽胞率快速提高，44～68 h時(shí)芽胞率由3%增長(zhǎng)至92%，因此認(rèn)為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04固態(tài)發(fā)酵的時(shí)間為68 h（圖8）。

圖8 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵的時(shí)效曲線Fig.8 Time effect curve of solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度對(duì)菌株BMF 04細(xì)胞總數(shù)和芽胞率有明顯影響，溫度為32 ℃時(shí)，細(xì)菌總數(shù)最高，為4.16×1010細(xì)胞/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），溫度高于或低于32 ℃時(shí)，細(xì)菌總數(shù)明顯下降。溫度對(duì)芽胞率影響較小，溫度高于 28 ℃時(shí)，芽胞率變化較小，因此選擇 32 ℃作為菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵溫度（圖9）。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.3 料水比對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 當(dāng)料水比為1:1時(shí)，細(xì)菌總數(shù)顯著高于其他處理（P＜0.05），為4.13×1010細(xì)胞/g，芽胞率為89.7%，料水比低于或高于1:1時(shí)，細(xì)菌總數(shù)均顯著下降。因此，菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基料水比為1:1（圖10）。

圖10 料水比對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.10 Effect of feed water ratio on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.4 接種量對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵的細(xì)菌總數(shù)有顯著影響。接種量為15%時(shí)，細(xì)菌總數(shù)顯著高于其他處理，為4.88×1010細(xì)胞/g；接種量低于15%時(shí)，芽胞率顯著低于其他處理，因此，選擇15%作為BMF 04菌株固態(tài)發(fā)酵最佳接種量（圖11）。

圖11 接種量對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.11 Effect of inoculation amount on solid state fermentation of strain BMF 04

2.2.5 初始pH值對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，pH對(duì)菌株BMF 04細(xì)菌總數(shù)影響明顯，不同pH時(shí)發(fā)酵物中細(xì)菌總數(shù)差異顯著，而對(duì)芽胞率影響較小。pH值為7時(shí)，發(fā)酵物中的細(xì)菌總數(shù)最高，為6.62×1010細(xì)胞/g，芽胞率為91.7%，pH高于7或低于7時(shí)細(xì)菌總數(shù)均顯著減少（圖12）。因此，BMF 04菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7。

圖12 初始pH值對(duì)菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵細(xì)菌總量和芽胞產(chǎn)率的影響Fig.12 Effect of initial pH value on solid state fermentation of BMF 04 strain

2.3 優(yōu)化后培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件的細(xì)菌總數(shù)和芽胞產(chǎn)率確認(rèn)

菌株BMF 04同時(shí)按優(yōu)化前和優(yōu)化后的條件進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，優(yōu)化后細(xì)菌總數(shù)為6.61×1010細(xì)胞/g，是優(yōu)化前的細(xì)菌總數(shù)的2.5倍，芽胞率達(dá)90.7%。

2.4 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵物對(duì)黃瓜幼苗的株高、莖粗、地上部和下部鮮重以及須根數(shù)有明顯影響，發(fā)酵物與土壤的比例不同，影響大小不同。質(zhì)量比為1:250時(shí)，黃瓜幼苗株高為（100.13±3.15）mm，較CK提高39%；地上鮮重為（4.77±0.21）g，較CK提高50%，莖粗與須根數(shù)較CK均有顯著增加（P＜0.05）（表4）。

表4 菌株BMF 04固態(tài)發(fā)酵物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)影響Table 4 Effect of solid fermentation of BMF 04 strain on cucumber seedling growth

3 討論

為了提高生防甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04發(fā)酵細(xì)菌總數(shù)與芽胞率，提高試驗(yàn)效率，降低生產(chǎn)成本，本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化培養(yǎng)基配方[18]。結(jié)果表明，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為：豆粕92.5%，菌糠6.7%，硝酸銨0.6%，氯化鈉0.2%。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04最佳發(fā)酵條件為：pH 7，料水比1:1，溫度32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間68 h，接種量為15%（種子液濃度為108細(xì)胞/mL），在此條件下，發(fā)酵物的細(xì)菌總數(shù)達(dá)6.61×1010細(xì)胞/g，芽胞率達(dá)到90.7%。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基中主要成分為豆粕，該發(fā)酵基質(zhì)不易結(jié)塊，有利于菌株的生長(zhǎng)繁殖[19,20]。添加蔗糖和葡萄糖BMF 04的細(xì)菌總數(shù)明顯低于對(duì)照，秦宇軒等[21]研究結(jié)果表明，蔗糖和葡萄糖具有高滲透壓，導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，引起微生物細(xì)胞脫水[22]；添加菌糠、玉米粉和米糠細(xì)菌總數(shù)較高，可能是由于這些物質(zhì)中除了含有菌株生長(zhǎng)所需的碳源外還含有其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如菌糠除含有大量的纖維素與半纖維素外，還含有豐富的食用菌菌體蛋白，能夠?yàn)榫晟L(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)[23]。

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和芽胞的形成受到無(wú)機(jī)鹽、培養(yǎng)溫度、pH等因素的影響[24-26]，本研究結(jié)果認(rèn)為BMF 04的發(fā)酵適溫為32 ℃，明顯低于唐曉星等[14]研究的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NCU507固態(tài)發(fā)酵最佳溫度40 ℃，發(fā)酵溫度越低，發(fā)酵耗能低，利于降低發(fā)酵成本，便于該菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用；發(fā)酵時(shí)間相比于李玉洋等[24]報(bào)道的多粘類(lèi)芽胞桿菌SH15最佳發(fā)酵時(shí)間144 h明顯縮短；本研究接種量為15%，遠(yuǎn)低于王卉等[27]研究的解淀粉芽胞桿菌L-S60 30%的接種量。熊濤等[28]的研究認(rèn)為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌B-1固態(tài)發(fā)酵最佳pH為7，與本研究結(jié)果初始pH 7相一致。

芽胞桿菌作為重要的生防資源，促生防病作用顯著，在植物病害防治上應(yīng)用廣泛。趙衛(wèi)松等[29]報(bào)道解淀粉芽胞桿菌PHODB35對(duì)番茄幼苗有明顯的促生作用，施用菌株后對(duì)株高、地上鮮重分別增加28.21%和22.59%；徐瑛等[30]報(bào)道解淀粉芽胞桿菌GB03對(duì)藜麥生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，GB03處理的藜麥根長(zhǎng)與對(duì)照相比提高31.19%，莖長(zhǎng)與對(duì)照相比提高6.26%。本試驗(yàn)利用甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04固態(tài)發(fā)酵物與土壤以1:250質(zhì)量比混合施用，黃瓜幼苗株高和根長(zhǎng)顯著高于對(duì)照（P＜0.05），增長(zhǎng)率分別為39%和50%，對(duì)黃瓜幼苗具有顯著的促生作用，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

與化學(xué)藥劑和化學(xué)肥料相比，利用生防菌株研制生防菌劑具有無(wú)污染、對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物病害防治的研究熱點(diǎn)，極具發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳?，本試?yàn)僅對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌BMF 04固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以及室內(nèi)對(duì)黃瓜的促生方面的進(jìn)行了研究，有關(guān)于相關(guān)菌株的制劑開(kāi)發(fā)和田間應(yīng)用效果有待進(jìn)一步研究。