韓多紅 王恩軍 張 勇 王紅霞 王 艷 王 富

（1河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，734000，甘肅張掖；2甘肅省河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，734000，甘肅張掖）

菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）為十字花科（Cruciferae）菘藍(lán)屬（Isatis）植物，產(chǎn)于我國(guó)江蘇、河南、河北、甘肅和黑龍江等地，其干燥根為中藥板藍(lán)根，性寒，味苦，具有清熱解毒、涼血利咽之功效，主治溫毒發(fā)斑、發(fā)熱咽痛、大頭瘟疫和臃腫等[1]。板藍(lán)根應(yīng)用廣泛，既是中醫(yī)臨床配伍的常規(guī)用藥，也是板藍(lán)根顆粒和復(fù)方板藍(lán)根顆粒等常用中成藥的主要藥材原料[2]。對(duì)于藥用植物來(lái)說(shuō)，干旱是所有自然災(zāi)害中危害最大的一種，具有發(fā)生頻率高、分布面積廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)及危害性大等特點(diǎn)[3]，它對(duì)藥用植物的影響大于其他非生物脅迫的總和，影響中藥材的品質(zhì)與資源[4]。近年來(lái)，有關(guān)多胺和甜菜堿對(duì)植物在逆境下的生理調(diào)控作用日益受到關(guān)注。

亞精胺（Spd）作為多胺中一種具有強(qiáng)烈生理活性的小分子脂肪族含氮堿，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有多方面的調(diào)節(jié)作用。外源Spd可通過(guò)提高脯氨酸合成代謝關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)脯氨酸和可溶性糖的積累，從而提高保水性和抗旱能力，還可通過(guò)抑制NADPH氧化酶活性提高抗氧化酶活力，降低活性氧，提高幼苗的抗旱性[5-6]。甜菜堿（GB）是一種水溶性生物堿，是甘氨酸甜菜堿的簡(jiǎn)稱，廣泛存在于植物中，在逆境下，它的積累可以增強(qiáng)植物的抗性[7]。研究表明，外源GB易于被植物葉片或根系吸收，且不易被快速降解[8]，因此通過(guò)施加外源GB提高植物抗旱能力是切實(shí)可行的。

目前，甘肅省正在大力發(fā)展中藥材產(chǎn)業(yè)，其中菘藍(lán)作為重點(diǎn)種植藥材，種植面積已達(dá)3萬(wàn)hm2左右。由于甘肅省大部分地區(qū)屬于干旱半干旱地區(qū)，水分虧缺每年都會(huì)造成部分藥材作物減產(chǎn)甚至死亡等情況。目前有關(guān)外源Spd和GB對(duì)菘藍(lán)在干旱脅迫下的生理調(diào)控作用及其生化響應(yīng)的研究尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)根施不同濃度的Spd和GB，研究干旱脅迫下兩者對(duì)菘藍(lán)種子萌發(fā)和幼苗抗氧化酶體系的生理響應(yīng)及其對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，探討緩解干旱脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為菘藍(lán)的抗旱栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用菘藍(lán)種子由甘肅省張掖市誠(chéng)泰藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所用的種子，實(shí)際為菘藍(lán)的果實(shí)，經(jīng)河西學(xué)院張勇教授鑒定為菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定 選取大小一致飽滿的菘藍(lán)種子，在水中浸泡12h后，用5%的NaClO溶液消毒3min，然后用蒸餾水沖洗干凈。設(shè)置PEG+Spd和PEG+GB的2個(gè)處理組（表1），濃度分別為 PEG-6000（10%）+Spd（0、25、50、75、100mg/L）和PEG-6000（10%）+GB（0、10、20、30、40mmol/L），對(duì)照（CK）為蒸餾水。采用濾紙發(fā)芽床，挑選消毒處理后的種子，分別放入墊有兩層濾紙的發(fā)芽盒中，分別加各處理液10mL，擺入50粒種子，3次重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定溫度25℃，光照時(shí)間10h，光照強(qiáng)度2 000lx。每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，第3天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（GV），第7天計(jì)算發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽指數(shù)（GI）和活力指數(shù)（VI）。GV=3d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/全部供試種子數(shù)×100%；GR=7d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/全部供試種子數(shù)×100%；GI=Σ（Gt/Dt），Gt為浸種后t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)；VI=S×GI，S為種子平均鮮重。

表1 PEG及外源Spd、GB濃度Table 1 Concentrations of PEG, exogenous Spd, and exogenous GB

1.2.2 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 選取籽粒大小一致飽滿的菘藍(lán)種子，用5%的NaClO溶液消毒3min，用蒸餾水沖洗干凈，在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸種催芽，待種子露白后播種于育苗缽內(nèi)，每缽種植10粒，用1/4的Hoagland培養(yǎng)液澆灌。播種后40d植株長(zhǎng)出2片真葉后開始脅迫處理，各處理液濃度見表1，每天每缽早晚各根施5mL處理液，以蒸餾水為對(duì)照（CK），處理7d后測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定游離脯氨酸含量[9]；采用TBA法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[9]；采用TYS-A型葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉綠素含量（SPAD值）[9]；采用電導(dǎo)儀法測(cè)定質(zhì)膜透性[9]；分別用愈創(chuàng)木酚法、氮藍(lán)四唑（NBT）顯色法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（P＜0.05），用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

由表2可以看出，在干旱脅迫（GH）處理下，菘藍(lán)種子的GR、GV、GI和VI分別較CK降低了61.29%、54.09%、59.82%和77.39%；在PEG+Spd組合中，從處理GH到T3，種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)呈不斷升高的趨勢(shì)，在T3時(shí)，GR、GV、GI和VI達(dá)到干旱脅迫（GH）處理后的最大值，分別比GH處理增加了70.38%、145.49%、108.33%和230.77%；T4處理種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)下降。在PEG+GB組合中，從處理GH到T3，種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)呈不斷升高的趨勢(shì)；T3處理GR、GV、GI和VI最大，分別比干旱脅迫（GH）處理增加了75.0%、180.41%、130.56%和269.23%。

表2 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)種子萌發(fā)的影響（x+s，n=3）Table 2 Effects of exogenous Spd and GB on seed germination of Isatis indigotica Fort. under drought stress

2.2 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗SPAD值的影響

由圖1可見，菘藍(lán)幼苗在干旱脅迫（GH）下的SPAD值比CK降低了34.25%，兩處理間存在顯著性差異（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB后，幼苗中SPAD值在T1至T3處理時(shí)逐漸升高，在T3處理時(shí)達(dá)到最大值，分別增至CK的97.33%和99.36%，與CK間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在T4處理（Spd 100mg/L、GB 40mmol/L）時(shí)，幼苗中SPAD值大幅下降。

圖1 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗SPAD值的影響Fig.1 Effects of exogenous Spd and GB on SPAD value of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.3 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗脯氨酸含量的影響

由圖2可見，菘藍(lán)幼苗在干旱脅迫（GH）下 的脯氨酸含量大幅升高，較CK增加了137.64%，兩處理間差異顯著（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB后，幼苗中脯氨酸含量逐漸下降，在T3處理（Spd 75mg/L，GB 30mmol/L）時(shí)降至最小值，分別較GH處理降低了48.67%和45.79%，但仍高于CK。在T4（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）處理時(shí)，幼苗中脯氨酸含量開始上升。

圖2 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗脯氨酸含量的影響Fig.2 Effects of exogenous Spd and GB on proline content of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.4 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗MDA含量的影響

由圖3可見，菘藍(lán)幼苗在干旱脅迫（GH）下的MDA含量大幅上升，較CK增加了248.69%。在添加外源Spd和GB后，幼苗中MDA含量在T1～T3處理時(shí)明顯下降，但在T4處理時(shí)上升。添加Spd處理下，T3（75mg/L）處理MDA含量降至最小，較GH處理下降了49.99%；添加GB處理下，T3（30mmol/L）處理MDA含量較GH處理下降了66.18%，且與CK間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗MDA含量的影響Fig.3 Effects of exogenous Spd and GB on MDA content of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.5 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性的影響

由圖4可見，在干旱脅迫（GH）下，菘藍(lán)幼苗的質(zhì)膜相對(duì)透性升高，較CK升高了85.62%，兩處理間差異顯著（P＜0.05）。在添加外源Spd和GB處理下，從T1到T3幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性逐漸下降，在T3處理（Spd 75mg/L、GB 30mmol/L）降至最低，分別為CK的119.11%和104.23%，且添加GB的T3處理與CK間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗質(zhì)膜相對(duì)透性的影響Fig.4 Effects of exogenous Spd and GB on relative permeability of plasma membrane of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

2.6 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5可見，干旱脅迫（GH）下菘藍(lán)幼苗中SOD活性升高，較CK升高了32.02%，2個(gè)處理間存在顯著性差異（P＜0.05）；在添加外源Spd和GB后，幼苗中SOD活性均出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在T3時(shí)達(dá)到最大。在T3處理時(shí)，添加Spd處理的SOD活性比GH處理增大127.33%，添加GB的處理增大152.15%。在T4處理（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）時(shí)，幼苗SOD活性下降，但均高于GH處理。

圖5 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗SOD活性的影響Fig.5 Effects of exogenous Spd and GB on SOD activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

由圖6可見，干旱脅迫（GH）下菘藍(lán)幼苗中POD活性升高，較CK升高了47.31%；在T1～T3處理下，幼苗POD活性不斷升高，在T4處理時(shí)下降；在T3處理時(shí)，添加Spd處理下的POD活性比GH處理增加了40.32%，添加GB的處理增加了48.90%。在T4（Spd 100mg/L，GB 40mmol/L）處理時(shí)，幼苗POD活性明顯下降，與GH處理間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖6 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗POD活性的影響Fig.6 Effects of exogenous Spd and GB on POD activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

由圖7可見，干旱脅迫（GH）下菘藍(lán)幼苗CAT活性提高，較CK升高了19.18%。在T1～T3處理下，幼苗中CAT活性不斷升高，GB處理的CAT活性升高幅度大于Spd處理；在T4處理時(shí)，幼苗的CAT活性下降。T3處理時(shí)，添加Spd的處理CAT活性比GH處理升高29.92%，添加GB的處理增加44.55%。

圖7 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗CAT活性的影響Fig.7 Effects of exogenous Spd and GB on CAT activity of Isatis indigotica Fort. seedlings under drought stress

3 討論

3.1 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要逆境因素，干旱脅迫通過(guò)滲透效應(yīng)影響種子的吸水作用，從而影響發(fā)芽[11]。發(fā)芽勢(shì)是表明種子的生活力、發(fā)芽整齊度和生產(chǎn)潛力的指標(biāo)，發(fā)芽率是反映種子發(fā)芽狀態(tài)最主要的指標(biāo)[12]。本研究中，10%的PEG-6000模擬干旱脅迫處理導(dǎo)致菘藍(lán)種子的發(fā)芽率等萌發(fā)指標(biāo)明顯降低，表明干旱脅迫對(duì)其種子萌發(fā)有一定的抑制作用，影響了種子萌發(fā)的速度、整齊程度和質(zhì)量。當(dāng)添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）時(shí)，種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均出現(xiàn)隨濃度增大而升高的趨勢(shì)，T3處理（Spd 75mg/L、GB 30mmol/L）各萌發(fā)指標(biāo)增加的幅度最大。表明外源Spd和GB對(duì)菘藍(lán)種子萌發(fā)期間的干旱脅迫具有明顯的緩解作用，這與張麗等[13]對(duì)麻黃種子的研究結(jié)果一致。

3.2 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，其含量反映植物葉片光合能力，干旱脅迫對(duì)葉綠素含量的影響是造成植物光合作用降低的重要原因[14]。本研究中，干旱脅迫使菘藍(lán)幼苗中葉綠素含量下降，但在添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）后，SPAD值上升，說(shuō)明外源Spd和GB能夠調(diào)節(jié)菘藍(lán)幼苗在干旱脅迫下的葉綠素含量，這與李麗杰等[15]對(duì)玉米和李冬等[16]對(duì)烤煙的研究結(jié)論一致。植株在逆境下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)越多，則表示其抗旱調(diào)節(jié)的能力越強(qiáng)[17]。本研究中，干旱脅迫下的脯氨酸含量大幅增加，在添加Spd和GB后，脯氨酸含量逐漸下降，但仍然高于對(duì)照，說(shuō)明外源Spd和GB能緩解干旱脅迫給植株葉片滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)所造成的壓力，這與尤東玲等[18]對(duì)玉米和鄒芳等[19]對(duì)甜高粱的研究結(jié)論一致。

質(zhì)膜透性和MDA含量是反映細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害程度和膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[20]。本研究中，干旱脅迫使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生了過(guò)氧化作用，誘導(dǎo)MDA含量增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的各種水溶液外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率增大；但在干旱脅迫下添加外源Spd（≤75mg/L）和GB（≤30mmol/L）后，MDA含量出現(xiàn)了降低，說(shuō)明外源適宜濃度的Spd和GB能夠緩解膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，降低質(zhì)膜透性，提高植株抗旱能力。

3.3 外源Spd和GB對(duì)干旱脅迫下菘藍(lán)幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

植物體內(nèi)O2-、H2O2和OH–等活性氧自由基在發(fā)生干旱時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生，它們啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化或膜脂脫脂作用，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，植物通過(guò)調(diào)節(jié)SOD、POD和CAT等內(nèi)源活性氧清除劑進(jìn)行清除[21]。本研究中，干旱脅迫誘使菘藍(lán)幼苗中POD、SOD和CAT活性均出現(xiàn)了小幅度升高，通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)緩解一定程度的干旱脅迫傷害；在添加外源Spd和GB后，POD、SOD和CAT活性均出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明外源Spd和GB能調(diào)控幼苗中抗氧化酶系統(tǒng)的活性，大幅度提高抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS的能力，增強(qiáng)植株在干旱逆境中的自我保護(hù)能力，這與張鳳等[22]和王貴平等[7]的研究結(jié)論一致，但過(guò)高的Spd和GB濃度會(huì)造成調(diào)控能力減弱。

亞精胺和甜菜堿均廣泛存在于植物中，在逆境下，植物體內(nèi)的亞精胺和甜菜堿含量均會(huì)出現(xiàn)明顯增加，其抗性也會(huì)提高，所以被廣泛用在植物抗逆性的研究方面。但適度干旱脅迫可提高藥用植物的品質(zhì)，增加次生代謝產(chǎn)物的積累，而添加外源Spd和GB后，盡管可以有效提高菘藍(lán)的抗旱性，但對(duì)其中根部有效成分[(R，S)-告依春]和葉中有效成分（靛玉紅）的積累影響如何，還需進(jìn)行深入研究。在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于甜菜堿的價(jià)格相對(duì)較低，且易于被植物葉片或根系吸收，所以在大田生產(chǎn)中可采用葉面噴施或灌根的方式使用；亞精胺由于價(jià)格昂貴，在大田生產(chǎn)中難以推廣使用。

4 結(jié)論

干旱脅迫對(duì)菘藍(lán)種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，但在添加一定濃度的外源Spd和GB后，可促進(jìn)種子萌發(fā)，增強(qiáng)幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性，提高抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS能力的閾值。其中，以75mg/L的Spd或30mmol/L的GB對(duì)干旱脅迫的緩解效果最佳，可有效提高菘藍(lán)的抗旱性。