王黎明 孔維瑋 高華利 ，3 董普輝 閆雪芳 王春平 王洪剛 李興鋒

（1河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，471003，河南洛陽；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，271018，山東泰安；3河南省黃泛區(qū)農(nóng)場，466000，河南周口）

脂肪氧化酶（LOX）是一種在自然界中廣泛存在的含非血紅素鐵的雙加氧酶，能夠催化含有順-順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多聚不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)和生成具有共軛雙鍵的過氧化合物的酶蛋白，屬于多聚不飽和脂類的酶系家族[1-4]。目前，小麥LOX基因家族中共鑒定到至少50個成員，可分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族，在50個TaLOX基因中有40個都是復(fù)制產(chǎn)生的，而TaLOX基因并非隨機分布，他們被分別定位在19條小麥染色體上[5]。LOX是一種存在于小麥籽粒中含量很低的酶蛋白，是茉莉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[6-7]，對小麥加工品質(zhì)和色澤起著重要作用[8-10]，LOX也是影響小麥面粉及其制品的口感、營養(yǎng)價值以及其能否吸引消費者的重要指標[11-14]。Leenhardt等[11]和Irvine等[12]的研究都認為小麥面粉中的LOX會偶聯(lián)氧化面粉中的類胡蘿卜素進行生物漂白，使小麥面粉具有白亮的色澤，從而使做出的面制品受到廣大消費者的青睞；LOX可以增強小麥中麥谷蛋白的交聯(lián)和氧化作用，提高麥類食品的口感和風(fēng)味[13]；同時LOX還可以氧化面粉及面粉制品中的脂類物質(zhì)，使其失去原本的麥香味，影響口感[14]。

開展小麥LOX活性的分布及其與加工品質(zhì)的相關(guān)性研究是諸多小麥研究者關(guān)注的重要問題。Borrelli等[15-16]認為LOX在小麥籽粒中的分布從外到內(nèi)逐漸遞減，在胚和糊粉層中的活性最高。Bao等[17]研究表明，小麥中LOX的活性與全麥粉的白度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與全麥粉的黃度呈極顯著負相關(guān)，并且產(chǎn)地不同的小麥品種（系）間的LOX平均活性的差異較大。王慧等[18]在對安徽省淮南片參加小麥區(qū)試5個生態(tài)點的10個小麥品種（系）的研究中發(fā)現(xiàn)，全麥粉LOX活性與小麥粉LOX活性呈極顯著正相關(guān)。Trufanov等[19]認為LOX活性與面團強度、形成時間、穩(wěn)定時間和延展性呈顯著負相關(guān)，與彈延比呈正相關(guān)；LOX活性過高會氧化小麥面粉中的一些營養(yǎng)物質(zhì)，造成營養(yǎng)流失[20-24]。所以LOX活性較低的小麥品種有利于提高小麥面粉的營養(yǎng)價值。低活性LOX的小麥品種還有利于小麥種子在儲藏過程中保持活力。Liu等[25]利用RNA i技術(shù)沉默了小麥LOX基因，發(fā)現(xiàn)小麥籽粒的LOX活性受到有效抑制。

鑒于LOX對小麥面粉及其加工品質(zhì)的重要影響，篩選小麥LOX活性等位基因并開發(fā)其特異標記是進行小麥LOX遺傳改良與分子育種的重要內(nèi)容。Geng等[9，26]通過雜交組合中優(yōu) 9507×CA9632構(gòu)建的重組自交系分別在染色體1AL和4B上檢測到了控制小麥LOX活性的QTL，2個基因?qū)ψ蚜OX活性的貢獻率分別為13.4%～25.2%和14.3%～27.0%，并在此基礎(chǔ)上克隆出等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b，這對等位基因位于普通小麥4BS上。根據(jù)等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b在第3外顯子上1個SNP的差異開發(fā)出了1對互補的顯性功能標記LOX16和LOX18[4]，這2個標記在LOX活性高和低的品種中分別擴增出489bp和791bp片段。吳萍[10]根據(jù)小麥LOX1基因本身的序列信息[27]開發(fā)了一個新功能標記LOX1-wp01，該標記可靠性強，而且采用帶型統(tǒng)計的方法在檢測中進行統(tǒng)計，操作方便、易于觀察。綜上所述，開展LOX活性研究對于小麥品質(zhì)改良與分子育種都具有非常重要的作用。

本研究利用標記LOX16和LOX18對來自中國7個麥區(qū)的436份小麥種質(zhì)進行分子檢測，明確其在TaLox-B1位點的等位基因變異類型，并對其在不同生態(tài)區(qū)的分布規(guī)律進行分析，在此基礎(chǔ)上，對自選高代小麥品系進行分子鑒定，以期為選育優(yōu)質(zhì)小麥品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥種質(zhì)包括來自7個小麥主產(chǎn)區(qū)的436份材料和課題組自選高代品系53個（表1）。所有材料均來自河南科技大學(xué)小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新課題組，于2014-2016年統(tǒng)一種植于河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)場，田間管理均按常規(guī)方法進行。

表1 供試小麥品種（系）及其麥區(qū)分布情況Table 1 Wheat cultivars (lines) from different wheat regions of China

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份供試材料取3粒代表性的種子培育發(fā)苗，取新鮮幼嫩的葉片，參照CATB法[28-29]提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。

1.2.2 STS功能標記 利用小麥4B染色體上LOX活性基因的STS功能標記LOX16和LOX18，檢測不同生態(tài)區(qū)小麥的LOX活性差異。所用STS標記序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成（表 2）。

表2 小麥4B染色體上LOX基因功能標記及其引物序列Table 2 Functional markers and primer sequences of LOX gene on wheat 4B chromosome

1.2.3 PCR擴增與電泳檢測 PCR反應(yīng)體系20μL，含20.0mmol/L Tris-HCl （pH8.4）2μL，20.0mmol/L KCl 2μL，2mmol/L dNTPs 2μL，15mmol/L MgCl22μL，每條引物各 0.5μL，TaqDNA 聚合酶 0.3μL（1.5U），模板 DNA 2μL（80ng），ddH2O 8.7μL。反應(yīng)在T100Thermal Cycler（Bio-Rad）擴增儀進行，采用Touchdown PCR程序：95℃預(yù)變性4min；95℃變性45s，65℃～53℃退火30s（每個循環(huán)降低0.3℃），72℃延伸2min，40個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保溫。擴增產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（39∶1）電泳進行檢測。緩沖液體系為1×TBE溶液，110V恒定電壓電泳3h（根據(jù)擴增片段大小、帶型及環(huán)境溫度適當調(diào)整電泳時間），銀染顯影后，用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)掃描成像并存入計算機。根據(jù)每個材料的檢測結(jié)果推斷其LOX活性基因類型，并進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同麥區(qū)小麥LOX基因分子檢測

利用LOX16與LOX18分子標記，對436份小麥材料LOX活性等位基因進行分子檢測。其中LOX16在TaLox-B1a（高LOX活性）基因型的材料中擴增出489bp的片段，在TaLox-B1b（低LOX活性）基因型的材料中無PCR擴增片段（圖1）；而LOX18標記在TaLox-B1b（低LOX活性）基因型的材料中擴增出791bp的片段，在TaLox-B1a（高LOX活性）基因型的材料中無PCR擴增片段（圖 2）。

圖1 標記LOX16檢測不同麥區(qū)部分小麥品種（系）TaLox-B1等位變異Fig.1 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX16 for TaLox-B1

圖2 標記LOX18檢測不同麥區(qū)部分小麥品種（系）TaLox-B1等位變異Fig.2 Allelic variation of wheat cultivars (lines) from different wheat regions tested by the marker LOX18 for TaLox-B1

2.2 不同生態(tài)區(qū)小麥LOX基因等位變異的區(qū)域分布

對436份小麥材料控制LOX活性等位基因變異進行分子檢測和統(tǒng)計分析，共獲得TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種基因變異類型（表3）。

從表3中看出，檢測出變異類型為TaLox-B1a的材料共有83份，所占比例較少，為19.0%；TaLox-B1b基因型的材料共有307份，所占比例最大，為70.4%；剩余46份變異類型為雜合型，所占比例為10.6%。

表3 不同麥區(qū)小麥TaLox-B1等位變異的分子檢測Table 3 Molecular detection of alleles of wheat TaLox-B1 in different wheat regions

從整體看，含有與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a的數(shù)量較少。不同生態(tài)區(qū)各等位基因變異類型的分布情況也不盡相同：與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a在不同生態(tài)區(qū)的分布比例均較少，其中，在黃淮冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布數(shù)目較多，比例分別為21.1%、19.8%和17.6%；與低LOX活性相關(guān)的基因TaLox-B1b在不同生態(tài)區(qū)的分布比例均較多，其中，在西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布所占比例分別為87.9%和72.5%；基因型為雜合型的材料在北部冬麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)分布較多，分別有15份和26份，比例分別為14.2%和12.4%。

2.3 自選高代小麥品系LOX基因的分子檢測

利用功能標記LOX16與LOX18對53份自選高代品系的LOX活性進行分子標記輔助選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自選品系僅僅得到了TaLox-B1b和雜合型2種基因變異類型，未檢測到變異類型為TaLox-B1a的材料。其中，雜合型的材料所占比例最大，共有32個，所占比例為60.4%，基因型TaLox-B1b的材料21個，占比為39.6%；自選材料中不含與高LOX活性相關(guān)的基因型TaLox-B1a。因此，要想獲得高LOX活性小麥品種（系），需要借助分子標記輔助選擇（MAS）手段繼續(xù)對后代品系進行進一步的選擇與鑒定。

3 討論

小麥品質(zhì)不僅受遺傳基因控制，也受環(huán)境因素影響，許多品質(zhì)性狀還會存在基因與環(huán)境互作的現(xiàn)象。小麥籽粒LOX是影響小麥面制品色澤的重要因素，了解不同生態(tài)區(qū)小麥品種（系）LOX基因等位變異類型及其分布有助于小麥LOX親本的選配及其早代LOX基因型的選擇。本研究結(jié)果顯示，供試小麥材料中具有LOX活性基因型TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型的頻率分別為19.0%、70.4%和10.6%。相吉山等[30]對195份新疆小麥品種的研究、張鈺玉等[31]對173份陜西小麥品種的研究和曹東等[32]對104份甘肅小麥品種的研究均表明：含有與高LOX活性相關(guān)的基因變異類型TaLox-B1a的比例遠遠低于含有與低LOX活性相關(guān)的基因變異類型TaLox-B1b，本研究的結(jié)果與其一致。造成這種結(jié)果的原因可能是由于LOX活性高的小麥籽粒往往不具有較高的耐儲藏性，因而在選育過程中遭到了淘汰。在生產(chǎn)過程中，可以根據(jù)不同的生產(chǎn)加工目的，分別選育適合加工高白度小麥制品的高LOX活性的小麥，或者是具有更高的耐儲藏性和營養(yǎng)價值更高的低LOX活性的小麥。Bai等[33]對123份新疆小麥品種的研究和張福彥等[34]對122份河南小麥品種的研究都表明，擁有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合的小麥品種（系）的LOX活性相對較高，而擁有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b基因型組合的小麥品種（系）的LOX活性相對較低。

本研究利用標記LOX16和LOX18對TaLox-B1位點檢測，發(fā)現(xiàn)供試材料中存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種變異類型。其中，雜合型共有46份，15份來自北部冬麥區(qū)，26份來自黃淮冬麥區(qū)，該類型的出現(xiàn)可能與育種家選育的品種非純合等因素有關(guān)。

本研究利用LOX活性相關(guān)基因的功能標記LOX16和LOX18鑒定了供試材料TaLox-B1位點的等位基因變異類型，篩選出了具有高LOX活性基因位點（組合）的優(yōu)質(zhì)品種（系），為小麥面制品的顏色改良提供了材料基礎(chǔ)。當我們在應(yīng)用這些標記進行分子標記選擇輔助育種時，若能與小麥早代材料的LOX活性直接測定相結(jié)合，則可以提高選擇的可靠性和育種的準確性；另外，還需要考慮與顏色相關(guān)的其他基因、性狀、環(huán)境及地域等的綜合影響。

4 結(jié)論

不同麥區(qū)小麥種質(zhì)在LOX活性基因TaLox-B1位點存在TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型3種基因變異類型。小麥TaLox-B1基因等位變異出現(xiàn)頻率不同，TaLox-B1a、TaLox-B1b和雜合型的檢出頻率分別為19.0%、70.4%、10.6%。小麥LOX活性等位變異基因在不同麥區(qū)的分布存在顯著差異，其中，基因型TaLox-B1a在黃淮冬麥區(qū)、北部冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布較多，基因型TaLox-B1b在西南冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)分布較多；這為LOX活性特異種質(zhì)的篩選與引種提供了參考。對自選高代品系MAS檢測發(fā)現(xiàn)，雜合型存在比例高達60.4%，說明MAS可以在早代有效檢出LOX基因等位變異位點的純合度，提高育種目標性狀的選擇效率。