劉曉麗 韓利濤 魏 楠 申 飛 蔡一林

（1河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，451450，河南鄭州；2西南大學(xué)玉米研究所，400715，重慶）

產(chǎn)量性狀由多基因控制，表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀遺傳，對(duì)產(chǎn)量性狀的研究可為育種工作提供重要的參考信息[1]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于玉米產(chǎn)量性狀的研究主要集中在控制產(chǎn)量性狀基因的定位方面[2]。籽粒的發(fā)育是影響產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，報(bào)道的玉米籽粒發(fā)生突變的基因有50多個(gè)[3]，大部分突變基因主要作用于胚乳細(xì)胞[4]或糊粉層細(xì)胞[5]，如ae1、su1、su2、wx、du、bt1和bt2等影響籽粒發(fā)育、淀粉形態(tài)、物理特性以及酶活性[5]；少部分突變基因，如os[6]、dek1[7]和mee1[8]等影響胚和胚乳特性[3]。

OsGS5是水稻中控制水稻籽粒大小和粒重的主效基因，該基因編碼絲氨酸羧肽酶，功能研究表明它是水稻中控制籽粒大小的正向調(diào)節(jié)因子。水稻基因組相對(duì)較小，OsGS5基因的克隆和功能研究已取得突破性的進(jìn)展，較高的OsGS5表達(dá)水平可參與促進(jìn)細(xì)胞周期循環(huán)，加快細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程，從而促進(jìn)水稻穎殼細(xì)胞的橫向分裂，增大穎殼的寬度，繼而加快谷粒的充實(shí)和胚乳的生長(zhǎng)速度，最終增大種子、增加谷粒重和單株產(chǎn)量。在除谷粒大小目標(biāo)性狀有差異而遺傳背景完全相同的兩個(gè)遺傳材料中，谷粒大的材料比谷粒小的含有較高OsGS5基因表達(dá)，大粒比小粒寬8.7%，千粒重增加7.0%，單株產(chǎn)量提高7.4%[9]。

水稻和玉米都是禾本科植物，來(lái)自一個(gè)共同的祖先，它們大約在5 500萬(wàn)年前開(kāi)始分化[10]。水稻和玉米基因組具有較高的線(xiàn)性，基因功能在這兩個(gè)作物之間也高度保守[11]。因此，玉米ZmGS5可能與水稻OsGS5一樣在玉米籽粒發(fā)育中發(fā)揮重要作用，從而影響玉米產(chǎn)量。從NCBI可下載到玉米同源旁系基因26個(gè)，但到目前為止，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)玉米ZmGS5基因的相關(guān)報(bào)道?；贠sGS5的研究，采用同源克隆的方法克隆ZmGS5，對(duì)其蛋白質(zhì)理化特性、空間結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，并對(duì)其在各組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，最后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對(duì)純合轉(zhuǎn)基因株系的千粒重進(jìn)行研究，為研究ZmGS5的生物功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試驗(yàn)材料為玉米自交系B73、Mo17、鄭58、昌7-2、黃C和178等；轉(zhuǎn)基因所需的模式植物為野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia生態(tài)型）。

1.2 菌種及主要試劑

轉(zhuǎn)基因所需的菌株為農(nóng)桿菌EHA105和大腸桿菌Trans 5α，植物表達(dá)載體為pCAMBIA3301。試劑及材料有克隆載體pGM-T vector、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、RACE PCR試劑盒（TIANGEN生物技術(shù)有限公司）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、草銨膦（phosphinothricin，PPT）、高保真酶HiFi（北京全式金生物技術(shù)有限公司）和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（QPS-201 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本TOYOBO公司）。引物合成和產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

分別收集玉米自交系B73穗期的根、莖、葉、雌穗、雄穗及授粉后14d的（14 days after pollination，14DAP）胚和胚乳，自交系Mo17、鄭58、昌7-2、黃C和178葉片于–80℃保存。采用Invitrogen公司的TRIzol裂解液提取總RNA，參照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280的吸光值來(lái)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。

1.4 cDNA第一條鏈的合成

RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為 40μL：20μL RNA、4μL dNTP mixture、8μL Rtbuffer、2μL RNase Inhibitor、2μL Reverse Transcriptase 和 4μL RNase free ddH2O。

1.5 基因克隆

通過(guò)NCBI網(wǎng)站下載OsGS5序列，利用Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具與玉米EST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并用BioEdit軟件將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行拼接，初步得到玉米的GS5基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物ZmGS5-F和ZmGS5-R（表 1）。

表1 所有PCR擴(kuò)增引物Table 1 Sequences of all PCR primers used

以B73 14DAP胚乳cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL反應(yīng)體系：2μL cDNA模板、2μL HiFi Buffer I、0.5μL dNTPs、1.5μL 特異性引物（上下游混合物）、0.3μL HiFi酶和13.7μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min；94℃ 45s，64℃ 45s，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，回收DNA目的片段，進(jìn)行克隆篩選后選取陽(yáng)性克隆送上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN軟件和BLAST檢索GenBank進(jìn)行多重序列比對(duì)和同源性分析。根據(jù)克隆測(cè)序的ZmGS5序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行3′和5′端RACE PCR擴(kuò)增。

以14DAP胚乳cDNA為模板，分別進(jìn)行第一次PCR和巢式PCR。第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20μL：1μL cDNA 模板、2μL HiFi Buffer I、0.5μL dNTPs、1μL 基因特異性引物 GSP1、1μL 通用引物UPM、0.3μL HiFi酶和14.2μL ddH2O，PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 3min；94℃ 30s，70℃ 45s，72℃2min，10 個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，66℃ 45s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。將第一次PCR產(chǎn)物稀釋20倍（取5μL產(chǎn)物用TE Buffer稀釋至100μL）作為巢式PCR的模板。巢式PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同上，產(chǎn)物回收進(jìn)行克隆篩選后送測(cè)序。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析

以玉米β-actin基因作為內(nèi)參基因，依據(jù)qRTPCR引物設(shè)計(jì)要求，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物ZmGS5-qF和ZmGS5-qR（表1）。玉米自交系B73根、莖、葉、雌穗、雄穗、14DAP胚和14DAP胚乳cDNA分別用ddH2O稀釋80倍后，采用CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系 12μL：6μL SYBR Premix EX，正反向引物各0.5μL，模板cDNA 5μL。每個(gè)樣品3次重復(fù)。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s、64℃退火/延伸30s（每次循環(huán)后采集熒光），40個(gè)循環(huán)，以每5s增加0.5℃的速度從65℃增至95℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析；試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Bio-Rad ManagerTM軟件進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCT法獲得ZmGS5基因的相對(duì)表達(dá)量[12]。

1.7 ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)分析

用 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析目的蛋白的氨基酸組成、等電點(diǎn)、分子量和帶正負(fù)電荷的殘基數(shù)；用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析目的蛋白的親/疏水性。

1.8 ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用SMART（http：//smart.embl.de/）分析目的蛋白結(jié)構(gòu)域；用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；分別用SOPM（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopm.html）和SWISS-MODEL Workspace（http：//swissmodel.expasy.org/workspace/）分析ZmGS5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.9 ZmGS5蛋白的功能預(yù)測(cè)

利用BaCelLo（http：//gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/）預(yù)測(cè)目的蛋白的亞細(xì)胞定位；利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行目的蛋白信號(hào)肽的分析；用NetPro 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析目的蛋白的磷酸化位點(diǎn)；利用 ProtFun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能；用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.10 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化[13]

1.10.1 超表達(dá)載體的構(gòu)建 采用質(zhì)粒提取試劑盒提取擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果均正確無(wú)誤的pGM-T-ZmGS5質(zhì)粒，然后用內(nèi)切酶Bgl II和Pml I分別對(duì)pGM-TZmGS5質(zhì)粒和pCAMBIA3301載體進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，且對(duì)ZmGS5目標(biāo)片段及pCAMBIA3301骨架進(jìn)行膠回收，然后通過(guò)連接酶對(duì)ZmGS5目標(biāo)片段和pCAMBIA3301骨架進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。

1.10.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài) 首先制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，然后將陽(yáng)性pCAMBIA3301-ZmGS5克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，陽(yáng)性菌液于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10.3 轉(zhuǎn)化野生型擬南芥 采用組培法培養(yǎng)野生型擬南芥，長(zhǎng)出四葉一心后移栽進(jìn)行土培，有花苞后用農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)侵染并轉(zhuǎn)化擬南芥。利用pCAMBIA3301載體上Kan和PPT抗性位點(diǎn)，用適當(dāng)濃度的Kan和PPT溶液進(jìn)行篩選，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性增加工作量，需要對(duì)T0疑似陽(yáng)性植株葉片DNA進(jìn)行序列檢測(cè)，最終篩選至T3代純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

1.10.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒重的測(cè)定 隨機(jī)選取若干擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，測(cè)定其T3代及同批次的對(duì)照野生型擬南芥種子的千粒重，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)。將T3代轉(zhuǎn)基因種子和對(duì)照野生型擬南芥種子用組培法（不含抗生素的固體培養(yǎng)基）在相同的條件下種植，同時(shí)移栽，進(jìn)行觀察鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGS5基因的克隆及分析

采用RACE PCR方法從玉米自交系B73 14DAP胚乳中克隆ZmGS5的全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)果（圖1）顯示，5′-RACE結(jié)果有500bp左右，3′-RACE結(jié)果有750bp左右。序列拼接后ZmGS5全長(zhǎng) cDNA 1 695bp，5′-UTR（非編碼區(qū)）長(zhǎng) 52bp，3′-UTR長(zhǎng)152bp，編碼區(qū)長(zhǎng)1 491bp，編碼496個(gè)氨基酸。

圖1 ZmGS5基因3′和5′端RACE擴(kuò)增Fig.1 Rapid amplification of 3′ and 5′ ends of ZmGS5

2.2 ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)

根據(jù)ZmGS5推測(cè)其編碼蛋白的氨基酸序列，利用ProtParam分析ZmGS5蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果顯示其分子量為55.45kDa，等電點(diǎn)為7.6。其一級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2）丙氨酸（Ala，10.1%）、亮氨酸（Leu，8.90%）、絲氨酸（Ser，8.70%）、纈氨酸（Val，7.50%）和甘氨酸（Gly，7.10%）的含量較多，而蛋氨酸（Met，1.40%）、半胱氨酸（Cys，1.6%）和色氨酸（Trp，2.20%）的含量較少，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）有48個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）有47個(gè)。ZmGS5蛋白的脂溶性指數(shù)為76.53，親水性指數(shù)為–0.264。ZmGS5蛋白親/疏水性結(jié)果（圖3）顯示，多肽鏈的第28位數(shù)值（2.778）最高，第335位數(shù)值（–3.211）最低，親水性氨基酸略多于疏水性氨基酸，初步判定其為親水蛋白[15]。

圖2 ZmGS5蛋白的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of ZmGS5

圖3 ZmGS5蛋白的親/疏水性分析Fig.3 ProtScale analysis of ZmGS5

2.3 ZmGS5蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

ZmGS5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與其他植物中的同源蛋白類(lèi)似，均是α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角依次遞減（圖4）。

圖4 不同植物ZmGS5同源蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of different plants homologous proteins of ZmGS5

利用SWISS-MODEL進(jìn)行進(jìn)一步空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖5）表明ZmGS5含有豐富的α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 ZmGS5蛋白的空間結(jié)構(gòu)Fig.5 Spatial structure of ZmGS5 protein

2.4 ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽及跨膜區(qū)

采用SMART預(yù)測(cè)ZmGS5蛋白的結(jié)構(gòu)域，從第64個(gè)氨基酸到第489個(gè)氨基酸之間有1個(gè)保守的Peptidase-S10結(jié)構(gòu)域，2個(gè)蛋白的E值都非常低，表明這個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟10超家族[16]，編碼絲氨酸羧肽酶，是一類(lèi)蛋白水解因子（表2）。

表2 ZmGS5和OsGS5蛋白的信號(hào)肽、重復(fù)組件和結(jié)構(gòu)域特征值Table 2 Confidently predicted signal peptides, repeats,and domains of OsGS5 and ZmGS5

使用SignalP 4.1 Server軟件預(yù)測(cè)ZmGS5蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果顯示在N端1-37氨基酸位置含有1個(gè)細(xì)胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽（表2，圖6），這是SCP氨基酸序列相似的蛋白質(zhì)（SCP-like proteins，SCPL），具有SCP的典型結(jié)構(gòu)特征，因此推測(cè)ZmGS5蛋白為分泌蛋白，這與其作為酶類(lèi)蛋白的生物學(xué)功能吻合。利用TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)ZmGS5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示其與水稻相同，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，表明ZmGS5蛋白為非膜蛋白。

圖6 ZmGS5蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of signal peptides of ZmGS5

2.5 亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)

利用軟件BaCelLo預(yù)測(cè)ZmGS5蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示其定位在葉綠體，定位過(guò)程為細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞器，再到葉綠體。

利用軟件NetPhos 2.0 Server預(yù)測(cè)ZmGS5蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示目的蛋白含有絲氨酸識(shí)別位點(diǎn)15個(gè)、蘇氨酸識(shí)別位點(diǎn)5個(gè)和酪氨酸識(shí)別位點(diǎn)14個(gè)，其中6個(gè)絲氨酸、2個(gè)蘇氨酸和9個(gè)酪氨酸識(shí)別位點(diǎn)與水稻相同（表3），表明玉米ZmGS5蛋白極有可能是被絲氨酸蛋白激酶、蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶進(jìn)行了磷酸化修飾而激活的，從而調(diào)控了二級(jí)響應(yīng)基因的表達(dá)。

表3 ZmGS5和OsGS5蛋白磷酸化位點(diǎn)比較Table 3 Comparison of ZmGS5 and OsGS5 in phosphorylation sites

2.6 序列多態(tài)性分析

2.6.1ZmGS5基因同源性分析 同源性分析表明，ZmGS5基因與大芻草TeGS5基因、高粱SbGS5基因、水稻OsGS5基因及擬南芥AtGS5基因序列的同源性高達(dá)60%～98%，其中與水稻的同源性達(dá)77%，與大芻草的同源性達(dá)98%（圖7）。

圖7 ZmGS5與其他植物GS5基因序列同源性分析Fig.7 The homology analysis of ZmGS5 and GS5 in other plants

2.6.2 基因及蛋白質(zhì)的多序列比對(duì) 以ZmGS5-F和ZmGS5-R為引物，以玉米自交系Mo17、昌7-2、鄭58、黃C和178 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果與B73中ZmGS5序列比對(duì)，結(jié)果顯示有3個(gè)堿基的插入或缺失，有17個(gè)SNP（single nucleotide polymorphism）位點(diǎn)（表4），說(shuō)明ZmGS5cDNA序列在玉米各自交系中具有較高的保守性。

玉米各自交系ZmGS5蛋白與水稻品種H94和Zhenshan97、擬南芥、大芻草及高粱GS5蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖8）顯示，所有氨基酸序列都在N端含有1個(gè)信號(hào)肽，都含有1個(gè)絲氨酸羧肽酶特有的Ser-Asp-His催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)（ISGESYAG），此結(jié)果與在水稻中的研究結(jié)果相同[9]。在11個(gè)玉米自交系中有7個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)與cDNA序列突變位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)（表4），其中，1個(gè)氨基酸插入或缺失，1個(gè)氨基酸的突變位點(diǎn)位于N端信號(hào)肽上，另外5個(gè)位點(diǎn)（44、230、293、465和486）位于Peptidase-S10保守結(jié)構(gòu)域上。

圖8 蛋白質(zhì)的多序列比對(duì)Fig.8 Alignment of the amino acid sequence

表4 ZmGS5基因cDNA序列和ZmGS5蛋白序列的等位基因的多態(tài)性Table 4 The change of allelic variation in cDNA sequences of ZmGS5 and amino acid sequence of ZmGS5

2.6.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 從NCBI下載玉米SCPL家族基因序列26個(gè)，與B73、Mo17、鄭58、昌 7-2、黃 C、178、H94、Zhenshan97、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大芻草和高粱中GS5蛋白序列比對(duì)，利用MEGA5.0軟件，選擇NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（圖9）顯示SCPL家族被分為4個(gè)群體，B73、Mo17、鄭58、昌7-2、黃C、178、H94、Zhenshan97、擬南芥、大芻草和高粱都處于第Ⅱ群體，B73與大芻草進(jìn)化關(guān)系最近。并且從圖9可看出GS5基因在各植物間進(jìn)化相對(duì)保守。

圖9 SCPL蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.9 Neighbor-joining tree of SCPL family proteins

2.7 ZmGS5基因在玉米不同組織中的表達(dá)分析

以玉米β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR分析ZmGS5在不同組織中的表達(dá)。結(jié)果（圖10）顯示，ZmGS5在雄穗和葉中表達(dá)量高，在胚和胚乳中表達(dá)量低，其表達(dá)量趨勢(shì)與GS5在水稻各組織中的表達(dá)量趨勢(shì)相似。水稻qRT-PCR結(jié)果顯示GS5在綠色組織葉中的表達(dá)量較高；非綠色組織中GS5的表達(dá)量在不同時(shí)期和不同長(zhǎng)短穗中相對(duì)較高，而在胚及胚乳中的表達(dá)量相對(duì)較低[23]，此結(jié)果為探索ZmGS5基因的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

圖10 ZmGS5基因在玉米不同組織中的qRT-PCR分析Fig.10 The qRT-PCR analysis of ZmGS5 gene expression in different tissues of maize

2.8 ZmGS5基因多態(tài)性與玉米籽粒大小的關(guān)系

上述11個(gè)玉米自交系籽粒表型各不相同（圖11）。Mo17籽粒最大，I15016籽粒最小，它們的cDNA序列和氨基酸序列有較大不同。11個(gè)自交系籽粒表型相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（表5）顯示，Mo17百粒重28.28g為最大值，I15016百粒重18.04g為最小值。綜合兩品種的測(cè)定結(jié)果，Mo17仍為11個(gè)自交系中的最大籽粒，I15016為最小籽粒，此結(jié)果與多序列分析結(jié)果相對(duì)照，11個(gè)自交系的籽粒表型差異顯著且序列有多個(gè)位點(diǎn)存在差異，推測(cè)存在差異的第15、23、44、230、293、465和486這7個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)可能在籽粒發(fā)育過(guò)程中起重要作用，可為其進(jìn)一步的功能驗(yàn)證提供參考信息。

圖11 11個(gè)自交系的籽粒表型Fig.11 Kernel phenotypes of eleven inbred lines

表5 11個(gè)自交系籽粒表型分析Table 5 Phenotypic analysis of eleven inbred lines kernels

2.9 ZmGS5基因轉(zhuǎn)化擬南芥

待野生型擬南芥抽薹3～8cm且剛開(kāi)始開(kāi)花時(shí)，將從B73中克隆的ZmGS5的cDNA序列連接到表達(dá)載體pCAMBIA3301上，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染花絮法將ZmGS5轉(zhuǎn)入擬南芥中，待到莢果自然成熟干燥后收取T0代種子。

2.10 陽(yáng)性ZmGS5轉(zhuǎn)基因種子的篩選

經(jīng)過(guò)抗生素篩選及基因序列檢測(cè)選出了T0代（圖12），繼續(xù)經(jīng)過(guò)抗生素篩選，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律T1代兩個(gè)株系都出現(xiàn)約3∶1的分離比（圖13）；T2代種子一些株系按照3∶1的分離比分離（培養(yǎng)基上部），而不發(fā)生分離的株系即為純合株系（培養(yǎng)基下部）；收取T2代純合株系的種子，得到T3代純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。

圖12 T0代擬南芥葉片檢測(cè)ZmGS5基因Fig.12 The detection of ZmGS5 in the leaves of T0 generation

圖13 T1代和T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選Fig.13 Screening of the T1 and T2 generations of transgenic Arabidopsis

2.11 ZmGS5基因?qū)M南芥籽粒重的影響

得到13個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系的255個(gè)擬南芥單株的T3代種子，以及5個(gè)單株同批次的野生型擬南芥種子。隨機(jī)選取37份T3代純合轉(zhuǎn)基因株系和5份野生型種子分別測(cè)定千粒重（表6），T3代千粒重最大值與最小值分別為0.0192和0.0147g。

表6 野生型和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的千粒重Table 6 The 1000-seed weight of the wildtype plants and T3 plants of Arabidopsis

與野生型擬南芥相比，所有T3代的千粒重均有所增加。野生型千粒重的平均值為0.0139g，T3代千粒重的平均值為0.0169g，相比野生型增加22.29%。顯著性測(cè)驗(yàn)（t0.01=2.704）結(jié)果顯示T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥千粒重之間達(dá)到極顯著水平，表明ZmGS5基因可以增加擬南芥的千粒重。

3 討論

經(jīng)過(guò)對(duì)ZmGS5分析可知，ZmGS5編碼的蛋白含有15個(gè)絲氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和14個(gè)酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，幾乎涉及所有的生理過(guò)程，如糖代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)等，是生物體中普遍存在的一種調(diào)節(jié)機(jī)制[14-15]，因此，這些磷酸化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可為ZmGS5在玉米生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的具體功能研究奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，ZmGS5編碼的絲氨酸羧肽酶是一類(lèi)真核生物蛋白水解酶，屬于α/β水解酶類(lèi)蛋白家族，絲氨酸羧肽酶屬于SC族羧肽酶中的S10家族[16]，SCPL基因在參與種子發(fā)育、種子萌發(fā)中貯藏蛋白的水解、細(xì)胞程序性死亡中細(xì)胞成分的自溶等過(guò)程中起作用。已有大量絲氨酸羧肽酶及其類(lèi)蛋白編碼基因從植物中分離出來(lái)，己從水稻、擬南芥、玉米、大麥、番茄和豌豆等高等植物中分離出SCP基因，且已從水稻、擬南芥和豌豆等植物中分離純化到SCP蛋白，并對(duì)其特性及表達(dá)進(jìn)行分析[17-20]。雖然絲氨酸羧肽酶及其類(lèi)蛋白家族龐大，成員眾多，但其確切的生物學(xué)功能尚不清楚[13]。

與OsGS5相比較可知，ZmGS5蛋白與OsGS5蛋白在結(jié)構(gòu)上相似，在N端都含有1個(gè)信號(hào)肽，都含有SCPL蛋白所特有的催化活性中心，且在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化中具有較高的親緣關(guān)系，在qRT-PCR分析中得到相同的結(jié)論。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行ZmGS5基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)篩選和鑒定后，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，最終得到純合T3代轉(zhuǎn)基因株系，通過(guò)對(duì)純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥進(jìn)行比較鑒定，推測(cè)ZmGS5基因在擬南芥中的功能。

4 結(jié)論

根據(jù)水稻中已經(jīng)克隆的決定籽粒大小的關(guān)鍵基因OsGS5，利用同源克隆的方法，從玉米基因組中克隆出1條全長(zhǎng)1 695bp的基因片段，開(kāi)放閱讀框1 491bp，編碼496個(gè)氨基酸殘基，蛋白序列與OsGS5基因編碼的蛋白序列高度同源，一致性達(dá)77%。推測(cè)ZmGS5在籽粒發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，從而影響玉米產(chǎn)量。ZmGS5可增加擬南芥千粒重。