郭小煒，李玉妍，王秀麗，楊忠鑫，陳南春，解慶林

(1 桂林理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2 桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；3 桂林理工大學(xué) 廣西巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 桂林 541006)

水凝膠是聚合物鏈通過(guò)物理、離子或共價(jià)相互作用交聯(lián)而合成的大分子聚合物凝膠，可通過(guò)氫鍵吸收大量的水[1]。水凝膠可以設(shè)計(jì)成具有優(yōu)選特性的藥物遞送系統(tǒng)，理想的水凝膠可以根據(jù)溫度和pH等物理變化選擇性釋放藥物[2-3]。

復(fù)合水凝膠是巨大的三維網(wǎng)狀聚合物，彼此通過(guò)化學(xué)或物理交聯(lián)而結(jié)合，它們的水合和多孔結(jié)構(gòu)可以模擬組織固有的特性、結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。可通過(guò)聚合物結(jié)構(gòu)中的功能基團(tuán)獲得改進(jìn)性能的復(fù)合水凝膠[4]。沸石分子篩具有獨(dú)特的孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積、可調(diào)節(jié)的酸堿位點(diǎn)等特征。同時(shí)沸石分子篩有較好的生物相容性和無(wú)毒性，使其在藥物遞送中得到廣泛的引用[5]，在聚合物中加入無(wú)機(jī)材料沸石分子篩，可以大大提高材料的力學(xué)性能[6]。CMC分子鏈中有多個(gè)羧基，與金屬離子具有出色配位能力[7]。由于CMC無(wú)毒性、良好的配位能力、可生物降解性和低成本優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出許多基于CMC的水凝膠。殼聚糖[8]是自然界中唯一的一個(gè)帶正電荷的天然高分子，其分子鏈上存在著大量的氨基基團(tuán)。CMC和CS兩者可以形成有效的結(jié)合，會(huì)使兩種高分子在水溶液中交聯(lián)，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，殼聚糖(CS)[9]和羧甲基纖維素(CMC)[10]已被用作pH敏感的藥物遞送系統(tǒng)。

二甲酸鉀(KDF)是一種略顯負(fù)電性的新型的綠色抗菌劑，添加到動(dòng)物飼料中具有降低胃腸道pH值、調(diào)節(jié)腸道微生物生態(tài)平衡、提高飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收等功能[11]。但直接飼喂KDF主要在小腸前端發(fā)揮作用，利用率不高，不能充分發(fā)揮二甲酸鉀調(diào)節(jié)腸道的作用。為解決這一問(wèn)題，本工作制備了全新的與Fe3+交聯(lián)的殼聚糖-羧甲基纖維素-P型分子篩復(fù)合水凝膠微球，具有高pH敏感性，可使二甲酸鉀穩(wěn)定到達(dá)腸道釋放并發(fā)揮抗菌作用。

因?yàn)閜H因素是控制藥物釋放的關(guān)鍵，本工作為控制KDF的釋放，提出了一種使用CS，CMC作為pH敏感聚合物的改進(jìn)方法。通過(guò)凝聚法制備了CS@CMC@Zeolite P@KDF復(fù)合水凝膠抗菌微球，用于在生理pH條件下選擇性釋放藥物，為KDF的有效利用提供了一種可行的模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度：>90.0%)，羧甲基纖維素(黏度：800～1200 mPa·s)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純CP；氯化鐵(FeCl3)，冰醋酸(CH3COOH)，西隴科學(xué)股份有限公司,分析純AR；二甲酸鉀晶體(≥98%)，武漢遠(yuǎn)成科技有限公司；PBS磷酸鹽粉劑(pH 7.2～7.4)，Phygene Scientific公司；Zeolite P實(shí)驗(yàn)室[12]和去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

Zeolite P表面和水凝膠微球內(nèi)表面(剖開(kāi))微觀形貌采用JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。Zeolite P物相分析采用X′Pert PRO型X射線粉末衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。采用ZS90 Zeta電位儀對(duì)不同pH下Zeolite P電位進(jìn)行測(cè)試。材料官能團(tuán)變化采用Thermo Nexus 470FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試分析。材料的穩(wěn)定性采用Q500 TGA熱重分析儀進(jìn)行測(cè)試表征。

1.2 水凝膠微球的制備

1.2.1 復(fù)合水凝膠微球的制備

Zeolite P(0%，0.5%，1.5%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)于100 mL去離子水中超聲分散10 min，緩慢加入3.0 g CMC，邊加邊攪拌，待CMC溶解后靜置12 h，得到溶液A。稱取2.0 g CS加入到100 mL冰醋酸(2%)，溶解后靜止12 h脫泡，得到溶液B。用5 mL針筒緩慢把溶液A滴加到4.0% FeCl3溶液中，交聯(lián)30 min，過(guò)濾洗滌，把CMC@Zeolite P凝膠微球放入溶液B，攪拌30 min，過(guò)濾洗滌，冷凍干燥即可得CS@CMC@Zeolite P復(fù)合水凝膠微球見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)合水凝膠微球

1.2.2 抗菌微球的制備

Zeolite P(0%，0.5%，1.5%)于100 mL去離子水中超聲分散10 min，加入0.4 g KDF攪拌3 h，加入3.0 g CMC，邊加邊攪拌，待CMC溶解后靜置12 h，得到溶液C。用5 mL針筒緩慢把溶液C滴加到4.0% FeCl3溶液中，交聯(lián)30 min，過(guò)濾洗滌，把CMC@Zeolite P@KDF凝膠微球放入溶液B，攪拌30 min，過(guò)濾洗滌，冷凍干燥即可得CS@CMC@Zeolite P@KDF復(fù)合抗菌微球。

1.3 測(cè)試分析

1.3.1 溶脹性分析

通過(guò)浸泡法測(cè)定水凝膠微球吸水性，研究其溶脹行為。配置3種不同pH值分別為1.2(模擬胃液)、6.8(模擬小腸液)、7.4(模擬大腸液)磷酸鹽緩沖溶液。準(zhǔn)確稱量0.02 g干燥后均勻復(fù)合水凝膠微球顆粒，浸泡在相應(yīng)pH磷酸鹽緩沖溶液中。緩慢攪拌，間隔一定的時(shí)間，取出微球，用濾紙吸附表面黏附的液體，立即稱重。通過(guò)公式(1)計(jì)算微球的溶脹率(S)：

(1)

式中：Mt為某一時(shí)間t水凝膠微球吸水膨脹后的質(zhì)量；M0為水凝膠微球的初始質(zhì)量。

1.3.2 KDF釋放行為

稱取定量KCl，以去離子水為溶劑，配制濃度為0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mg/L的鉀離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定各濃度的吸光度，得到鉀離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程式(2)為：

y=0.03116x+0.01507

(2)

式中：y代表吸光度，x代表鉀離子濃度，相關(guān)系數(shù)R2=0.99676。

稱取1.74 g NaH2PO4，2.7 g Na2HPO4和1.7 g NaCl，溶解在400 mL去離子水溶液，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.4。將0.4 g抗菌微球碾碎置于50 mL溫度為37 ℃的磷酸鹽緩沖溶液中(pH=7.4，不含鉀離子)，緩慢攪拌，使KDF充分溶出，離心得到上清液。利用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定鉀離子的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式(2)，計(jì)算抗菌微球中KDF的含量。并按式(3)計(jì)算包封率(EE)，按式(4)計(jì)算載藥率(LC)：

(3)

(4)

式中：m1為抗菌微球中KDF含量,g；m2為KDF投加量,g；m3為抗菌微球的質(zhì)量,g。

分別稱取0.4 g形貌完整的復(fù)合抗菌微球，置于100 mL磷酸鹽緩沖溶液，于常溫緩慢攪拌，每次取1 mL溶液適當(dāng)稀釋，定時(shí)段通過(guò)原子吸收分光光度計(jì)測(cè)試，每次取出溶液之后，立刻添加相同體積、相同pH值的磷酸鹽緩沖溶液，根據(jù)鉀離子標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算KDF的含量，考察抗菌微球中KDF的釋放情況。

1.3.3 體外抗菌測(cè)試

采用微孔板法進(jìn)行體外抗菌測(cè)試,用抗菌微球和液體培養(yǎng)液(胰蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，氯化鈉0.5 g，100 mL去離子水溶解，調(diào)節(jié)pH為7.2，高溫高壓滅菌20 min)配制濃度為48 mg/mL抗菌液，將48 mg/mL母液依次稀釋為24，12 mg/mL。向樣品測(cè)定孔中加入上述濃度的抗菌液和純液體培養(yǎng)液各200 μL，每個(gè)濃度重復(fù)3組實(shí)驗(yàn)，依次加入大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液10 μL，于37 ℃條件下，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，每隔4 h用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為630 nm處測(cè)定其吸光度(即OD 630 nm值)，每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zeolite P特征分析

圖2為制備的Zeolite P XRD圖譜，與Zeolite P的標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS card No.01-071-0962表現(xiàn)出較高的匹配，衍射峰位置基本一致[14]。圖3為制備的Zeolite P的SEM圖，Zeolite P平均粒徑大小為0.5 μm。

圖2 P型分子篩XRD圖譜

圖3 P型分子篩的掃描圖

圖4為隨pH變化Zeolite P的Zeta電位圖，曲線與0電位的交點(diǎn)為5.37，當(dāng)溶液pH值大于5.37時(shí)，Zeolite P表面帶負(fù)電荷，具有吸附陽(yáng)離子的能力；當(dāng)溶液pH值小于5.37時(shí)，Zeolite P表面帶正電荷，具有吸附溶液中陰離子的能力。當(dāng)pH值在3.0～5.37之間，Zeolite P表面呈正電位，同時(shí)由于其較高的比表面積，為吸附KDF提供了條件。結(jié)果表明，在pH值為3.0～5.37條件下，Zeolite P和KDF有較好的結(jié)合能力。孟祥儉等[15]利用XPS表征沸石分子篩與KDF的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果表明Al2p周圍化學(xué)環(huán)境發(fā)生了變化，周圍電子云密度降低，應(yīng)該是KDF與分子篩形成了氫鍵；同時(shí)分子篩中的鈉周圍的環(huán)境也發(fā)生變化，可能是KDF中的鉀將分子篩中的鈉取代。表明Zeolite P對(duì)KDF有較好的吸附作用。

圖4 P型分子篩的Zeta電位

2.2 復(fù)合水凝膠微球的形貌和結(jié)構(gòu)分析

圖5為復(fù)合水凝膠微球的內(nèi)剖圖，內(nèi)部為致密的結(jié)構(gòu)，EDS結(jié)果顯示含有Zeolite P的特征元素Al和Si，表明Zeolite P鑲嵌在CMC三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，對(duì)復(fù)合水凝膠微球骨架具有支撐作用。

圖5 CS@CMC@Zeolite P內(nèi)剖圖(a)及其內(nèi)表面EDS譜圖(b)

對(duì)原材料Zeolite P，CMC，CS，CS@CMC@Zeolite P進(jìn)行紅外分析，分析結(jié)果如圖6所示。與CMC和CS中的3458，3431 cm-1處峰值相比，CS@CMC@Zeolite P羥基峰特征峰變得寬且大，紅移到3420 cm-1，說(shuō)明CS，CMC和Zeolite P之間存在氫鍵用力；同時(shí)CS@CMC@Zeolite P中的特征峰衍射峰偏移到1596 cm-1，這是由于CS中—NH2基團(tuán)(1644 cm-1)與CMC中的—COOH基團(tuán)(1623，1418 cm-1)相互作用，CS與CMC通過(guò)離子鍵與氫鍵形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。CS@CMC@Zeolite P特征峰中存在600～1000 cm-1Zeolite P骨架震動(dòng)特征峰，但是強(qiáng)度有所減小，說(shuō)明Zeolite P被包覆在復(fù)合水凝膠微球中。

圖6 紅外對(duì)比譜圖

2.3 復(fù)合水凝膠微球的熱穩(wěn)定性分析

圖7為CMC，CS，CS@CMC，CS@CMC@Zeolite P各組的熱重分析曲線。可以發(fā)現(xiàn)CS@CMC與CS@CMC@Zeolite P在前期主要為結(jié)合水的蒸發(fā)，隨后在200 ℃開(kāi)始緩慢分解。分解溫度小于CS和CMC的裂解溫度，這是由于兩種高分子材料混合后產(chǎn)生的離子鍵作用力會(huì)削弱兩種高分子本身分子內(nèi)部以及同類分子之間的相互作用力[16-17]。但是離子鍵的存在會(huì)提升整體的熱穩(wěn)定性，對(duì)比同時(shí)失重50%質(zhì)量的溫度可知：CS@CMC在溫度455 ℃才損失一半質(zhì)量，而CS與CMC分別在325 ℃和365 ℃已經(jīng)損失一半質(zhì)量，說(shuō)明CS@CMC比天然高分子具有更高的熱穩(wěn)定性，這是由于聚合物結(jié)構(gòu)的改變以及CMC與Fe3+的相互作用。然而在加入Zeolite P后，觀察到其在損失50%質(zhì)量時(shí)的溫度低于CS@CMC體系，這可能是由于Zeolite P的塑化作用，增加了CMC基質(zhì)中的孔隙度，降低了CMC基質(zhì)在特定溫度范圍的穩(wěn)定性。TGA的分析結(jié)果可從側(cè)面反映出兩種高分子之間存在著離子鍵的結(jié)合，CS@CMC@Zeolite P體系在常溫是熱穩(wěn)定的。

圖7 熱重分析譜圖

2.4 復(fù)合水凝膠溶脹行為分析

圖8為Zeolite P添加量在不同pH磷酸鹽緩沖溶液對(duì)CS@CMC@Zeolite P溶脹行為的影響。復(fù)合水凝膠微球的溶脹行為可表明液體滲透到CS@CMC@Zeolite P微球中的速度和容易程度，以及對(duì)環(huán)境pH的敏感性。圖8顯示了不同pH下復(fù)合水凝膠微球的溶脹率之間的顯著差異，表明復(fù)合水凝膠微球?qū)H高度敏感。在酸性條件下，CMC鏈形成緊密的螺旋狀，CMC結(jié)構(gòu)壓縮，溶脹得到抑制。因此，在pH從1.2增加到7.4的過(guò)程中，CS@CMC鏈上的羧基轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電荷的羧酸根離子，導(dǎo)致更高的靜電斥力和水被吸收。同時(shí)CS包裹在CMC外部，形成的聚電解質(zhì)復(fù)合物，避免水凝膠微球的瓦解。加入的Zeolite P鑲嵌纏繞在CMC三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中，限制了聚合物鏈的擴(kuò)展，導(dǎo)致其溶脹率比CS@CMC偏小。CS@CMC@Zeolite P在酸性條件下具有較小的溶脹率，可以減緩KDF溶出釋放。所制備的CS@CMC@Zeolite P水凝膠微球能夠應(yīng)用于不同pH條件下的可持續(xù)給藥系統(tǒng)。

圖8 不同pH CS@CMC@Zeolite P微球溶脹行為

2.5 KDF緩釋行為分析

圖9為Zeolite P添加量對(duì)CS@CMC@Zeolite P釋放KDF的行為影響，在pH為7.4的環(huán)境下，CS@CMC@KDF突釋現(xiàn)象明顯，后續(xù)對(duì)KDF的釋放也較快；添加Zeolite P之后CS@CMC@Zeolite P可有效減緩?fù)会尙F(xiàn)象的發(fā)生，且對(duì)KDF具有有效的控釋行為。由于KDF是水溶性的，導(dǎo)致包封率和載藥率相對(duì)較低，添加1.5%Zeolite P抗菌微球具有最大包封率37.17%和最大載藥率12.39%。

圖9 Zeolite P添加量在pH=7.4環(huán)境下CS@CMC@Zeolite P@KDF微球釋放KDF行為分析

KDF的釋放模型見(jiàn)圖10。在酸性環(huán)境中，CS表面的氨基基團(tuán)緩慢電離，質(zhì)子化的氨基在微球表面形成了水合層，阻礙水分子滲入微球，同時(shí)CMC鏈段在酸性環(huán)境中卷曲收縮，與內(nèi)部的Zeolite P共同延緩了水分子進(jìn)入微球內(nèi)核，使KDF的溶出變得困難。在pH=7.4環(huán)境下，CMC表面的羧基去質(zhì)子化，分子鏈段舒展，導(dǎo)致更多的水分子穿透聚合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)入到水凝膠微球的內(nèi)部，使KDF更加容易釋放。KDF在中性或偏堿性環(huán)境中電離增強(qiáng)，溶解度增加。Zeolite P的含量增加，使KDF從微球內(nèi)核遷移到表面更加的困難。釋放結(jié)果表明，制備的CS/CMC/Zeolite P復(fù)合水凝膠微球載藥體系，可用于胃腸道pH敏感環(huán)境中KDF的控釋。

圖10 CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球KDF的釋放示意圖

對(duì)添加1.5% Zeolite P抗菌微球進(jìn)行釋放動(dòng)力學(xué)研究(表1)，零級(jí)釋放模型用來(lái)解釋一些常見(jiàn)的糖衣藥物和膠囊藥物的釋放過(guò)程。一級(jí)釋放模型一般適用包含水溶性藥物的多孔基質(zhì)。Higuchi方程常擬合藥物濃度擴(kuò)散過(guò)程。

表1 釋放動(dòng)力學(xué)模型

對(duì)添加1.5% Zeolite P抗菌微球進(jìn)行釋放動(dòng)力學(xué)方程擬合(圖11)。在pH=7.4環(huán)境中CS@CMC@Zeolite P相關(guān)系數(shù)R2在零級(jí)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程以及Higuchi擬合方程中分別為0.48945，0.79629和0.7209。KDF的控釋符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Higuchi擬合方程。所制備的復(fù)合抗菌微球?qū)DF具有一定的控釋作用，KDF的釋放為溶出擴(kuò)散機(jī)制，形成了較為穩(wěn)定的多孔水溶性微球。

圖11 CS@CMC@Zeolite P@KDF微球在腸道模擬中動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果

2.6 抗菌微球抑菌行為分析

KDF被動(dòng)物食用后，可以降低胃腸道的pH值，控制細(xì)菌的生長(zhǎng)。同時(shí)KDF在通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁后解離并對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生破壞作用，未分離的KDF可以通過(guò)微生物的半透膜擴(kuò)散到它們的細(xì)胞質(zhì)中；一旦進(jìn)入細(xì)胞，環(huán)境pH值在7附近，KDF就會(huì)解離并抑制細(xì)胞酶和營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，從而殺死細(xì)菌并抑制細(xì)菌的繁殖。細(xì)菌需要營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持自身的新陳代謝，并與宿主競(jìng)爭(zhēng)胃和腸道的營(yíng)養(yǎng)。胃和腸道中細(xì)菌的數(shù)量越少，動(dòng)物可以吸收的營(yíng)養(yǎng)就越多[18-19]。使用KDF來(lái)減少胃腸道中的致病性和非致病性細(xì)菌對(duì)于動(dòng)物的膳食能量利用是可行有效的。

圖12為不同CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球含量對(duì)大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)生長(zhǎng)的影響。CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球?qū)Υ竽c桿菌和金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌效果，隨著抗菌微球濃度越高，其抑菌效果更明顯?？咕⑶蚩捎行б种萍?xì)菌的滯后期，隨著濃度的增加，細(xì)菌的滯后時(shí)間越長(zhǎng)，表明抗菌微球抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，影響了細(xì)菌生長(zhǎng)所需的酶、能源和中間代謝產(chǎn)物。同時(shí)，細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期也明顯縮短。與王秀麗等[20]制備的Zeolite P抗菌劑相比，相同抗菌液濃度，具有更高的抑菌性，所制備的CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球能負(fù)載有效的KDF，具有更優(yōu)異的抗菌性。在24 mg/mL和48 mg/mL濃度下，細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，較多菌體死亡，幾乎不再繁殖，但是在低濃度時(shí)(12 mg/mL)具有時(shí)效性?？深A(yù)見(jiàn)的高濃度下的抗菌液具有較低的pH值，可以改變細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境，抑制細(xì)菌的繁殖。當(dāng)抗菌液分解完之后，細(xì)菌開(kāi)始快速繁殖。

圖12 不同抗菌微球含量對(duì)大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的生長(zhǎng)影響

3 結(jié)論

(1)通過(guò)凝聚法，經(jīng)Zeolite P吸附KDF分散在CMC基質(zhì)中，F(xiàn)eCl3作為交聯(lián)，與CS組裝制備出了KDF緩釋抗菌微球。CS與CMC通過(guò)離子鍵形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，形成的水凝膠微球比天然高分子材料CS和CMC具有更高的熱穩(wěn)定性，Zeolite P鑲嵌纏繞在CMC基質(zhì)中。

(2)CS@CMC@Zeolite P吸水溶脹差異性表明復(fù)合水凝膠微球具有高pH敏感性。CS@CMC@Zeolite P@KDF抗菌微球?qū)DF具有良好的控釋效果，添加Zeolite P可有效減小突釋現(xiàn)象的發(fā)生，且對(duì)KDF具有更為優(yōu)異的控釋效果。通過(guò)釋放動(dòng)力學(xué)線性擬合，釋放過(guò)程遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Higuchi模型，所制備的抗菌微球?qū)DF具有一定的緩釋作用。

(3)制備的抗菌微球CS@CMC@Zeolite P@KDF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制生長(zhǎng)的效果，在抗菌液濃度為24,48 mg/mL時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，幾乎不再繁殖，低濃度下具有時(shí)效性，但前期仍具有抗菌性。所制備的CS@CMC@Zeolite P@KDF體系為KDF的推廣和使用提供了參考。