范澤文，趙新宇，邱 帥，王 艷，郭 靜，權(quán)慧欣，徐蘭娟

(1 大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院，遼寧 大連 116034;2 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 大連 116011;3 鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院,鄭州 450007)

骨組織生物工程支架材料可用于骨的修復(fù)和替代，能夠?yàn)樘囟ǖ募?xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還可以作為模板引導(dǎo)組織再生和控制組織結(jié)構(gòu)。骨組織支架材料的選擇、改性和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)已經(jīng)成為骨組織生物工程材料領(lǐng)域中重要的研究方向[1-3]。3D打印技術(shù)近來(lái)已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4]，其最大的優(yōu)勢(shì)是可利用數(shù)字化模型快速成型精準(zhǔn)復(fù)雜的制品。多孔支架的成型可以借助3D打印技術(shù)獲取適合的孔徑，調(diào)控細(xì)胞在支架表面和內(nèi)部的生長(zhǎng)、增殖和分化。

聚乳酸(PLA)因其具有良好的物理、化學(xué)和生物性能，被廣泛應(yīng)用于組織工程支架領(lǐng)域，但同時(shí)存在生物活性低和韌性差等缺點(diǎn)，這極大限制了PLA在骨組織生物工程材料領(lǐng)域的應(yīng)用[5-6]。Rosenzewig等[7]采用3D打印技術(shù)成功制備ABS和PLA兩種生物支架，并對(duì)原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)、生存能力和組織代謝等進(jìn)行研究。除了直接對(duì)PLA進(jìn)行打印外，對(duì)其改性也是研究的重點(diǎn)。Tiziano等[8]采用3D打印成型方法，用聚乙二醇(PEG)和具有生物活性的磷酸鈣(CaP)玻璃對(duì)PLA進(jìn)行改性并成功制備生物支架。結(jié)果表明，隨著PEG的加入，PLA/PEG/CaP玻璃復(fù)合材料的親水性和彈性模量會(huì)增加，而PEG含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合材料三維結(jié)構(gòu)不均勻及力學(xué)性能的下降；體外降解研究表明，PEG的加入顯著加速?gòu)?fù)合材料的降解速度，同時(shí)也改善了PLA的加工性能。

本工作通過(guò)利用PEG的兩親性、生物相容性[9]以及HA的生物活性和對(duì)PLA的增強(qiáng)效果[10]，通過(guò)共混改性獲取力學(xué)性能改善和生物相容性好的PLA/PEG/HA復(fù)合線材，并利用熔融沉積(FDM)3D打印技術(shù)獲取多孔支架。并證明了復(fù)合材料具有良好的生物相容性，為PLA復(fù)合材料在生物工程支架領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

聚乳酸：4032D，美國(guó)NatureWorks公司；聚乙二醇：相對(duì)分子量2000，日本青木株式會(huì)社；羥基磷灰石：5～20 μm，上海圻明生物科技有限公司。

1.2 樣品制備

將PLA在80 ℃烘箱中干燥12 h后與PEG/HA(按不同比例)熔融混合擠出(轉(zhuǎn)矩流變儀，Polylab QB)，包括純PLA共6組，并牽引獲得直徑約為1.75 mm的線材。質(zhì)量組成分別為(1)PLA：質(zhì)量為200 g；(2)～(6)：PLA與PEG的質(zhì)量比均為9∶1，且總質(zhì)量為200 g，HA的添加量分別為0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同),2%(4 g),4%(8 g),6%(12 g),8%(16 g)。試樣(1)～(6)依次簡(jiǎn)稱為PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8。

1.3 結(jié)構(gòu)表征與性能測(cè)試

1.3.1 3D打印力學(xué)試樣及多孔支架表征

根據(jù)GB/T 1040標(biāo)準(zhǔn)，利用CAD設(shè)計(jì)拉伸、沖擊試樣的3D打印模型和多孔支架模型，如圖1(a)，(b)所示(d=14 mm，h=2 mm)。按1.2節(jié)的方法制備線材并3D打印試樣。CR-10(400)型3D打印機(jī)參數(shù)及設(shè)置：噴頭內(nèi)徑0.4 mm，溫度200 ℃，底板溫度40 ℃，打印層厚0.1 mm，打印速率50 mm/s，填充率100%(線性填充)；打印方向如圖1(a)所示(拉伸試樣平行于拉伸方向，沖擊試樣垂直于沖擊方向)。多孔支架的打印條件不變，填充率為0。

圖1 3D打印拉伸、沖擊試樣模型(a)和多孔支架模型(b)

1.3.2 DSC分析

分別稱取一定量的PLA,HA0,HA2,HA4,HA6,HA8用作DSC(QAT-2000)測(cè)試，起始溫度40 ℃，以10 ℃/min升溫到200 ℃，保持3 min再以10 ℃/min降溫到40 ℃，消除熱歷史后以10 ℃/min升到200 ℃，記錄第二次升溫曲線。

1.3.3 流動(dòng)性分析

把擠出線材于190 ℃，10 MPa模壓成直徑25 mm，厚度1 mm的圓片。依靠DHR-2型旋轉(zhuǎn)流變儀運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生剪切流動(dòng)來(lái)確定材料的黏性。測(cè)試條件：剪切掃描模式，溫度190 ℃，剪切速率1～3500 rad·s-1。

1.3.4 支架形態(tài)及細(xì)胞黏附SEM觀察

HA2復(fù)合材料線材做原料，將圖1(b)的多孔支架模型實(shí)體打印出來(lái)。在JSM6460LV型掃描電子顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察。

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化后離心，重懸制備成細(xì)胞懸液后以1×105個(gè)/孔的濃度接種到支架材料表面培養(yǎng)24 h，室溫下4%多聚甲醛固定6 h，經(jīng)30%,40%,50%,70%,80%,90%,95%,100%濃度無(wú)水乙醇脫水，每一濃度脫水15 min，100%濃度脫水兩次，充分干燥后于掃描電鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.5 細(xì)胞骨架及細(xì)胞核的激光掃描共聚焦(LSCM)觀察

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化后離心，重懸制備成細(xì)胞懸液后以1×105個(gè)/孔的濃度接種到支架材料表面培養(yǎng)24 h，室溫下4%多聚甲醛固定30 min后分別進(jìn)行鬼筆環(huán)肽和DAPI染色，清洗后于FV1000型激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 力學(xué)性能測(cè)試

拉伸性能測(cè)試(Instron5900電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī))：將復(fù)合材料線材及3D打印(啞鈴形)樣條在室溫下以20 mm/min的拉伸速率進(jìn)行靜態(tài)拉伸測(cè)試，記錄材料的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量。

沖擊性能測(cè)試(XJUY-22Z懸臂梁沖擊試驗(yàn)機(jī))：缺口深度2 mm，記錄沖擊強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 3D打印線材的力學(xué)性能分析

3D打印線材力學(xué)性能的好壞直接影響著打印制品的質(zhì)量。圖2為PLA/PEG/HA復(fù)合線材的力學(xué)性能測(cè)試曲線。添加PEG后PLA的斷裂伸長(zhǎng)率由約10%提高到約18%，因?yàn)镻EG可以充當(dāng)PLA的增塑劑，有助于PLA分子鏈的伸展，并且PEG分子能進(jìn)入到PLA大分子中增加PLA分子的空間體積，削弱PLA分子的相互作用力從而增加PLA韌性[11]。添加HA后斷裂伸長(zhǎng)率迅速下降，HA屬無(wú)機(jī)粒子，具有小尺寸效應(yīng)，它的添加會(huì)阻礙HA0分子鏈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，降低HA0的韌性，但有增強(qiáng)PLA的作用；所以復(fù)合材料在屈服之前，HA2的彈性模量要比PLA高，HA4,HA6也依然如此，HA6的彈性模量最高，比PLA高出約1 GPa。但HA8無(wú)論是拉伸強(qiáng)度還是彈性模量表現(xiàn)均較差，這可能是由于HA含量過(guò)高產(chǎn)生了團(tuán)聚，另一個(gè)原因可能是HA可以充當(dāng)PLA異相成核劑誘導(dǎo)其結(jié)晶[12]，并因HA含量過(guò)高可能使晶粒結(jié)晶不完善產(chǎn)生缺陷導(dǎo)致力學(xué)性能下降[13]。這與后邊DSC的分析結(jié)果一致。PLA/PEG/HA線材的具體拉伸性能參數(shù)如表1所示。

圖2 PLA/PEG/HA線材的拉伸性能曲線

表1 PLA/PEG/HA線材的拉伸性能

2.2 3D打印線材的熱性能分析

圖3 PLA/PEG/HA復(fù)合材料的DCS曲線

表2 PLA/PEG/HA復(fù)合材料的結(jié)晶參數(shù)

2.3 3D打印線材的流動(dòng)性分析

線材的流動(dòng)性和黏度對(duì)成型制品的好壞有直接的影響，圖4為PLA/PEG/HA復(fù)合材料的流動(dòng)性曲線。在低剪切頻率下表觀黏度(η*)基本保持不變，表現(xiàn)為牛頓流體特性，在高剪切頻率下熔體表現(xiàn)為剪切變稀，為典型的假塑性非牛頓流體行為。在剪切速率較小時(shí)，PLA和HA0的η*較大，這可能是因?yàn)镻LA的分子鏈和PEG的分子鏈可以形成一種擬網(wǎng)狀的纏結(jié)結(jié)構(gòu)使阻力增加導(dǎo)致的[17]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HA0的η*比PLA大，這可能是因?yàn)镻EG分子進(jìn)入到PLA大分子中增加了整個(gè)鏈的纏結(jié)使阻力增加所導(dǎo)致的。摻入HA后HA2的η*下降很多，這可能是因?yàn)樵诩羟羞^(guò)程中HA粒子可以充當(dāng)潤(rùn)滑劑，使運(yùn)動(dòng)單元躍遷較為容易。對(duì)于HA4和HA6組分來(lái)說(shuō)，初始η*降到最低，在410 rad/s下HA6的η*只有7.2×10-4Pa·s，而在適當(dāng)?shù)募羟兴俾氏?8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔體黏度要比PLA降低4個(gè)數(shù)量級(jí)。這除了在高剪切的作用下，HA充當(dāng)潤(rùn)滑劑的作用也尤為明顯。HA8因?yàn)镠A粒子間也存在一定的摩擦力，潤(rùn)滑劑的作用明顯下降。從而阻礙了運(yùn)動(dòng)單元的躍遷，所以HA8的η*不降反升。而降低PLA的η*也有助于其加工成型和3D打印成型。

圖4 PLA/PEG/HA復(fù)合材料的表觀黏度(η*)與剪切速率(ω)曲線

2.4 3D打印試樣的力學(xué)性能分析

2.4.1 3D打印拉伸試樣力學(xué)性能分析

選取4組力學(xué)性能較好的線材來(lái)做3D打印的原料，4組打印線材分別是PLA,HA0,HA4和HA6。擠出過(guò)程中發(fā)現(xiàn)HA8線材的流動(dòng)性不好，不適合做打印線材。圖5為力學(xué)試樣的打印實(shí)體，觀察發(fā)現(xiàn)其打印質(zhì)量與成型精度都很高。說(shuō)明挑選的線材完全可以3D打印，這為后期打印多孔支架提供了可行性保障。

圖5 3D打印拉伸和沖擊試樣的光學(xué)圖片

圖6為3D打印樣條拉伸測(cè)試曲線。與線材結(jié)果類似，PEG的添加增加PLA分子的空間體積，有助于PLA分子鏈運(yùn)動(dòng)，從而提高其韌性。HA雖有增強(qiáng)高分子材料的作用，但3D打印成型由于其增材的特性，會(huì)削弱試樣的整體性，導(dǎo)致HA增強(qiáng)效果下降，不過(guò)依然保留了一定的力學(xué)性能可以滿足多孔支架的基本要求。

圖6 3D打印試樣的拉伸性能曲線

2.4.2 3D打印沖擊試樣的力學(xué)性能分析

表3為3D打印成型沖擊試樣的測(cè)試結(jié)果。如表所示PLA的沖擊強(qiáng)度為1.744 kJ/m2，而PEG的添加增加了PLA分子的空間體積，有助于PLA分子鏈的運(yùn)動(dòng)從而提高其韌性，使HA0沖擊強(qiáng)度提高。然而，HA雖有增強(qiáng)PLA的作用，但它的添加使材料剛性增加，降低沖擊強(qiáng)度。而且3D打印成型會(huì)使制品中存在打印結(jié)點(diǎn)，削弱材料的整體性；并且打印方向與沖擊方向垂直，這些可能都會(huì)在一定程度上削弱PEG的增韌效果，降低HA0沖擊強(qiáng)度。DSC和線材拉伸結(jié)果表明，PEG增韌明顯，而且與PLA相容性較好，這使得即使添加HA后，沖擊強(qiáng)度還是會(huì)得到較大的保留，依然高于純PLA。

表3 3D打印PLA/PEG/HA復(fù)合材料的沖擊性能

2.5 多孔支架的結(jié)構(gòu)及生物相容性分析

組織工程支架的孔結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖有重要的影響，其中孔徑的尺寸在很大程度上決定著細(xì)胞能不能在支架材料中遷移和生長(zhǎng)[18]。圖7為3D打印PLA/PEG/HA復(fù)合材料多孔支架的SEM照片。圖7(a)為多孔支架的表面，其孔徑約為800 μm；圖7(b)為它的局部表面放大圖。圖7(c)為多孔支架斷面，其孔徑約為400 μm；圖7(d)為其局部斷面放大圖。從圖7(a)～(d)可以看出3D打印多孔支架實(shí)體的孔徑十分規(guī)整，打印效果好且打印精度高，這為細(xì)胞在支架材料中遷移、生長(zhǎng)以及動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的可行性提供基礎(chǔ)保證。此外，從圖7(e)～(f)能看出，支架表面存在一定的粗糙度。這對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化等也起到促進(jìn)作用。

圖7 PLA/PEG/HA復(fù)合材料多孔支架的SEM照片

細(xì)胞在材料表面的黏附、鋪展對(duì)評(píng)價(jià)組織工程材料的性能具有相當(dāng)重要的意義。圖8為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)在多孔支架上的黏附和標(biāo)記的結(jié)果。圖8(a)為大鼠BMSC在多孔支架上的黏附狀況，細(xì)胞在材料表面12 h即形成了穩(wěn)定的黏附，并從圖8(b)可看出部分細(xì)胞開始在材料表面鋪展，表明支架具有良好的生物相容性。并且通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope, LSCM)對(duì)大鼠BMSC在支架表面上的黏附進(jìn)行觀察。圖8(c)為大鼠BMSC的24 h細(xì)胞骨架的熒光標(biāo)記結(jié)果，圖8(d)為大鼠BMSC的24 h細(xì)胞核熒光標(biāo)記結(jié)果，結(jié)果顯示大鼠BMSC的細(xì)胞核和細(xì)胞骨架形態(tài)良好，表明多孔支架具有良好的生物相容性且無(wú)毒性。這為PLA/PEG/HA復(fù)合材料成為骨組織工程材料提供了重要的保障，也拓寬了3D技術(shù)在定制生物支架上的應(yīng)用。

圖8 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞在多孔支架上的生物相容性測(cè)試

3 結(jié)論

(1)利用熔融共混技術(shù)制備不同組分的PLA/PEG/HA復(fù)合線材，并通過(guò)分析復(fù)合材料的各種性能，篩選出適合3D打印成型的線材，并成功制備出力學(xué)性能優(yōu)異的試樣及生物相容性好、孔徑規(guī)整的多孔支架。

(2)PEG的添加把PLA線材斷裂伸長(zhǎng)率由約10%提高到約18%，Tcc降低約18 ℃；加入HA后，PLA的彈性模量最多提高約1 GPa，Tm最多降低約7 ℃；而在適當(dāng)?shù)募羟兴俾氏?8～20 rad·s-1)，HA4,HA6的熔體黏度要比PLA降低4個(gè)數(shù)量級(jí)。

(3)多孔支架的表面孔尺寸約為800 μm，斷面孔尺寸約為400 μm；這個(gè)孔徑的支架表面適合細(xì)胞的黏附、增長(zhǎng)與分化；多孔支架與細(xì)胞12 h即形成了穩(wěn)定的黏附與鋪展；24 h后，細(xì)胞骨架與細(xì)胞核的形態(tài)良好，細(xì)胞生長(zhǎng)、生存狀況極佳。多孔支架的成功制備，為其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供了一些數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步發(fā)掘改性3D打印線材在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用提供了可能。