安 敏，高振軍

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院消化科，上海 210007)

流行病學(xué)研究[1-2]顯示，與正常人群相比較，潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)患者癌癥的風(fēng)險(xiǎn)高出5.7倍，疾病診斷后10年、20年、30年結(jié)直腸癌累積發(fā)生率分別為1.6%、8.3%和18%。5-氨基水氧酸(5-Aminosalicylic acid，5-ASA)是治療UC及維持輕中度UC患者緩解的常用藥物，研究顯示，5-ASA和磺胺嘧啶可顯著降低UC患者大腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。薈萃分析[5]顯示，口服1.2 g/d ASA的UC患者大腸癌發(fā)生優(yōu)勢(shì)比為0.551，在更高劑量下可降低至0.23。雖然多項(xiàng)研究表明長(zhǎng)期服用5-ASA具有抗腫瘤作用，但5-ASA對(duì)UC的治療和化學(xué)預(yù)防機(jī)制仍不明確。在嚙齒類(lèi)大腸癌模型中，5-ASA可抑制腫瘤生長(zhǎng)并減少異常隱窩病灶數(shù)量[6]。5-ASA已在幾種不同的大腸癌(Colorectal cancer，CRC)細(xì)胞系中以時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式顯示生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。在文獻(xiàn)報(bào)道的由氨基水楊酸調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)中，目前研究較多的包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)途徑以及環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)，但5-ASA調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的確切分子靶點(diǎn)和途徑尚未完全明確[7-8]。缺乏β-catenin或COX-2或具有突變形式的CRC細(xì)胞系也會(huì)對(duì)5-ASA的暴露產(chǎn)生反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯或凋亡或腫瘤形成能力下降，提示在5-ASA的作用機(jī)制中涉及替代途徑，并且5-ASA的抗炎作用與細(xì)胞培養(yǎng)模型中的抗癌作用一致[9-10]。在早期的一項(xiàng)研究中，5-ASA在LS180結(jié)腸癌細(xì)胞系中抑制了TC22和一種與CRC相關(guān)的新型原肌球蛋白亞型[11]。因此，5-ASA的潛在抗癌作用部分歸因于與阿司匹林的結(jié)構(gòu)相似，并可能由PPARγ和NF-κB p65介導(dǎo)。本研究選擇既往文獻(xiàn)報(bào)道中與致癌和炎癥相關(guān)的基因進(jìn)行觀察，旨在了解長(zhǎng)期使用美沙拉嗪后結(jié)腸組織的分子變化為臨床相關(guān)濃度下5-ASA的化學(xué)預(yù)防作用提供臨床數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集在青浦區(qū)中山醫(yī)院青浦分院接受長(zhǎng)期美沙拉秦治療的61例UC患者作為研究對(duì)象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡18～65歲，性別不限；②持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作性黏液血便、腹痛伴有不同程度全身癥狀，聯(lián)合腸鏡和(或)黏膜活檢確診為UC，病情嚴(yán)重程度輕、中度；③持續(xù)服用美沙拉秦≥2年；對(duì)研究知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：重度UC；采用≥20 mg以上類(lèi)固醇激素治療者；合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；既往有胃腸道手術(shù)史者；合并惡性腫瘤患者；孕期或哺乳期婦女；精神疾病或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙者；擬納入或已納入其他臨床研究者。共納入患者61例，其中男39例，女22例；年齡23～61歲，平均(41.83±11.566)歲；病程3～12年，平均(5.38±2.46)年；病變范圍：全結(jié)腸炎37例，左側(cè)結(jié)腸炎25例。

1.2 研究方法 患者每天服用1.5～3.0 g美沙拉秦(批號(hào)：080328)維持治療，藥物劑量由臨床醫(yī)師根據(jù)病情判定。治療前和治療2年時(shí)給予結(jié)腸鏡檢查，活檢標(biāo)本取自直腸、乙狀結(jié)腸，標(biāo)本分為兩份，一份用福爾馬林固定進(jìn)行病理分級(jí) ，另一份-80 ℃快速冷凍用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR),分析。基線和2年時(shí)評(píng)估患者的Mayo活動(dòng)指數(shù)(Mayo AI)，Mayo AI包括大便頻數(shù)、血便、醫(yī)師評(píng)分和黏膜表現(xiàn)等4個(gè)條目，每個(gè)條目以4級(jí)法進(jìn)行評(píng)分，分別得分0～3分，其中黏膜表現(xiàn)參照內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果：0分表示正常和靜止性炎癥，1分表示輕度炎癥，2分表示中度炎癥，3分表示嚴(yán)重炎癥，可伴自發(fā)性出血、潰瘍等表現(xiàn)。組織病理學(xué)評(píng)分根據(jù)Nancy組織病理學(xué)評(píng)分進(jìn)行病理分級(jí)，分為0～3分，分別代表無(wú)活動(dòng)性炎癥、輕度活動(dòng)性炎癥、中度活動(dòng)性炎癥和重度活動(dòng)性炎癥。隨訪時(shí)Mayo AI≤1分定義為顯效，Mayo AI或組織病理學(xué)評(píng)分降低≥1分定義為有效，否則定義為無(wú)效，顯效加有效定義為治療有效。

1.3 RT-PCR檢測(cè) 用羅氏Lightcycler和Qiagen SYBR綠色PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。所有樣品在95 ℃下變性45 s，然后在62 ℃和72 ℃下分別進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增周期，每次10 s和12 s。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，用檢測(cè)引物對(duì)兩份樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)使用2-ΔΔCt方法將測(cè)試樣品的閾值(Ct)與肌動(dòng)蛋白(β-actin，內(nèi)部對(duì)照)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化。基因引物見(jiàn)表1。治療前后基因變化率=(治療后基因相對(duì)表達(dá)量-治療前基因相對(duì)表達(dá)量)/治療前基因相對(duì)表達(dá)量×100%。

表1 相關(guān)基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床特征和美沙拉秦治療后病情變化 61例患者隨訪時(shí)病情緩解(Mayo AI≤1分)30例，活動(dòng)期UC(Mayo AI>1分)31例；服用美沙拉嗪1.5 g/d者34例，3.0 g/d者27例，1.5 g/d和3.0 g/d美沙拉秦患者臨床療效均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(82.35%與77.78%,χ2=0.199，P=0.655)；根據(jù)Mayo AI評(píng)分有49/61例(80.33%)患者被歸于治療有效。根據(jù)組織病理學(xué)檢查，38/61例(62.30%)患者的組織病理學(xué)有所改善，17/61例患者保持不變，6/61例(9.84%)出現(xiàn)組織病理學(xué)惡化(炎癥程度增加)。

2.2 患者治療前后結(jié)腸黏膜相關(guān)基因表達(dá)水平比較 治療后患者細(xì)胞增殖核抗原(Ki-667)、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1(CEACAM-1)、BCL2L1、P53、CXC趨化因子配體10(CXCL10)、PPAR-γ、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)水平均較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后患者細(xì)胞分裂周期因子25A(CDC25A)、CTNNB1、COX-2、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平均低于治療前，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 患者治療前后結(jié)腸黏膜癌相關(guān)基因表達(dá)水平比較

續(xù)表

2.3 患者治療前后Mayo AI評(píng)分和Nancy組織病理評(píng)分比較 治療后患者M(jìn)ayo AI評(píng)分和Nancy組織病理評(píng)分均較治療前顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 患者治療前后Mayo AI評(píng)分和Nancy組織病理評(píng)分比較(分)

2.4 變量與美沙拉秦用藥時(shí)間的多元線性回歸結(jié)果 以治療前后變量為應(yīng)變量，將性別、年齡、病變部位、病程、治療前Mayo AI評(píng)分、Nancy組織病理評(píng)分、美沙拉秦劑量、美沙拉秦治療時(shí)間等變量引入多元線性回歸，結(jié)果顯示，藥物應(yīng)用時(shí)間與Ki-67、NF-κB、PPAR-γ、COX-2、IL-8、CXCL10、CDC25A基因變化率顯著相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 變量與美沙拉秦用藥時(shí)間的多元線性回歸結(jié)果

3 討 論

臨床研究表明柳氮磺胺吡啶和5-ASA對(duì)UC具有抗癌作用，但這些作用的分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究的目的是測(cè)量長(zhǎng)期5-ASA治療對(duì)UC患者結(jié)腸活檢組織中致癌相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而為5-ASA的化學(xué)預(yù)防作用提供分子基礎(chǔ)。既往研究[12]顯示，NF-κB(p65)、PPAR-γ、COX-2、CXCL10、TNF-α、IL-8、CDC25A、p53等基因參與介導(dǎo)5-ASA對(duì)結(jié)直腸細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、促凋亡、抗氧化、抗菌和抗炎作用。其他靶基因，如增殖標(biāo)記物Ki-67也被用作癌癥的預(yù)后標(biāo)記物[13]。BCL2L1是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)基因，編碼抗凋亡的Bcl-xL和促凋亡的Bcl-xS剪接變體、CEACAM-1也是與結(jié)腸癌相關(guān)的基因[14]。本研究觀察了癌癥及炎癥相關(guān)基因與5-ASA長(zhǎng)期治療的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸活檢組織中COX-2、CDC25A、CXCL10、IL8、NF-κB和Ki-67轉(zhuǎn)錄水平變化與5-ASA治療持續(xù)時(shí)間相關(guān)。這些抗炎和細(xì)胞周期調(diào)控基因降低可通過(guò)5-ASA的抗癌作用和降低疾病活動(dòng)進(jìn)行解釋?zhuān)?-ASA的抗炎作用與抗癌作用可能存在重疊。既往研究[15-17]證實(shí)，UC的嚴(yán)重程度與炎癥程度呈正相關(guān)，與結(jié)腸炎相關(guān)的發(fā)育不良和結(jié)直腸癌密切相關(guān)。但有研究[18]顯示，一些已知參與癌變過(guò)程的基因(PPARγ、CEACAM、β-catenin和P53)的表達(dá)減少與患者UC疾病活動(dòng)性無(wú)關(guān)。此外，COX-2、IL-8和TNF被認(rèn)為是炎癥的重要標(biāo)志物，與炎癥的臨床表現(xiàn)(Mayo AI和組織學(xué))相關(guān)，而與炎癥和癌變相關(guān)的Ki-67、NF-κB和CXCL10僅與內(nèi)窺鏡表現(xiàn)相關(guān)。這可能提示5-ASA即使在沒(méi)有明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎活動(dòng)情況下也具有癌癥化學(xué)預(yù)防作用?？紤]到本研究中獲得的活檢樣本是包括上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞的細(xì)胞群，僅根據(jù)基因表達(dá)的變化難以詳細(xì)區(qū)分5-ASA抗炎和抗癌效果，未來(lái)研究中評(píng)估這些基因在5-ASA治療患者活檢組織中的原位表達(dá)或蛋白水平，將為5-ASA分子靶點(diǎn)的作用提供更多的證據(jù)。

在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和小鼠UC模型中，5-ASA暴露產(chǎn)生的抗炎和抗腫瘤作用伴隨著PPARγ水平的升高，在某些情況下，COX-2表達(dá)同時(shí)降低。據(jù)報(bào)道，與健康志愿者相比，UC患者的PPARγ水平顯著降低，并且局部使用羅格列酮(一種PPARγ激動(dòng)劑)治療的活動(dòng)期UC患者的Mayo內(nèi)窺鏡評(píng)分降低程度與5-ASA相似[19]。然而，在本研究中，PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平與疾病活動(dòng)性或疾病持續(xù)時(shí)間無(wú)關(guān)。然而，COX-2的表達(dá)與5-ASA暴露時(shí)間顯著相關(guān)。細(xì)胞學(xué)研究[20]顯示，每隔24 h反復(fù)暴露于2 mM 5-ASA可持續(xù)抑制與炎癥、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)和凋亡有關(guān)的基因靶點(diǎn)(Ki-67、CXCL10、IL-8、BCL2L1、CASP8和CDC25A)。這些觀察結(jié)果表明，長(zhǎng)期堅(jiān)持美沙拉秦方案是獲得最大療效必要條件。

這些結(jié)果表明，美沙拉秦長(zhǎng)期治療可調(diào)控與癌變相關(guān)的多個(gè)基因，為UC患者長(zhǎng)期使用美沙拉秦作為結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防提供了依據(jù)。