杜蘇豐，孫萬(wàn)里，郭新成

(1.西安市胸科醫(yī)院結(jié)核內(nèi)科，陜西 西安 710100；2.西安市胸科醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710100；3.漢中市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 漢中 723000)

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)是一種嚴(yán)重的醫(yī)院獲得性肺炎，為患者機(jī)械通氣治療中常見(jiàn)的并發(fā)癥。其發(fā)病主要與機(jī)械通氣或外源性氣管插管有關(guān)[1-2]。危重癥患者常有多種侵入性操作史，機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)，引起代謝異常、機(jī)體營(yíng)養(yǎng)水平低下、免疫水平降低，使感染發(fā)生幾率大大增加[3]。機(jī)械通氣易引起患者發(fā)生VAP，其發(fā)病率高、病死率高[4]，嚴(yán)重影響患者的身心健康。

隨著抗生素的廣泛使用，腸桿菌、銅綠假單胞菌以及鮑曼不動(dòng)桿菌等病原菌的耐藥性日益嚴(yán)重[5]。腸桿菌是目前VAP中最常見(jiàn)的病原菌之一，其耐藥機(jī)制主要與產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-Lactamase,ESBLs)有關(guān)，對(duì)產(chǎn)ESBLs 腸桿菌所致的各類(lèi)感染疾病為亟待解決的問(wèn)題[6]。自然殺傷(Natural killers，NK)細(xì)胞是一種淋巴細(xì)胞，為機(jī)體免疫系統(tǒng)第一道防線，能發(fā)揮重要的細(xì)胞毒性效應(yīng)快速消滅靶細(xì)胞，有研究表明，NK細(xì)胞數(shù)量對(duì)肺炎的預(yù)后有重要指導(dǎo)意義[7]。T細(xì)胞亞群是極為重要的參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞群，以 CD4+、CD8+為代表，多種感染性和免疫性疾病常以二者比值對(duì)細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估[8]。本研究通過(guò)對(duì)ESBLs-VAP患者NK細(xì)胞和T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)引起ESBLs-VAP的危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，以期為臨床提供一定依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以90例2016年2月至2020年3月收入的重癥肺炎行機(jī)械通氣發(fā)生VAP患者為研究對(duì)象，以感染ESBLs腸桿菌 VAP患者為研究組，共28例，以未感染ESBLs腸桿菌 VAP患者為對(duì)照組，共62例?；颊咭话阗Y料如表1所示，兩組患者年齡、性別、發(fā)生VAP時(shí)間、通氣時(shí)間及住院時(shí)間等一般資料經(jīng)比較分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性?；颊呒凹覍倬浞至私庋芯?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的準(zhǔn)許。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷、預(yù)防和治療指南》中關(guān)于VAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者使用呼吸機(jī)通氣48 h后所發(fā)生的肺炎；③胸部 X 影像學(xué)檢查顯示可見(jiàn)新發(fā)生的或表現(xiàn)為進(jìn)展性的浸潤(rùn)陰影；④氣管和支氣管內(nèi)有膿性分泌物出現(xiàn)；患者體溫>38.0 ℃或<36.0 ℃；患者外周血白細(xì)胞>10.0×109/L 或<4.0×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①資料不完全者；②機(jī)械通氣時(shí)間未達(dá)到48 h；③機(jī)械通氣<48 h前痰培養(yǎng)檢查顯示有病原菌者；④無(wú)法自主呼吸，需使用呼吸機(jī)維持生命者；⑤氣管插管后短期死亡者；⑥有應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑史者。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：所有患者均于入住ICU時(shí)、機(jī)械通氣48 h及第7天抽取肘靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于實(shí)驗(yàn)管中分別加入20 μl鼠抗人特異性單克隆抗體(PerCP-CD3、PE-CD8及FITC-CD4)，再加入100 μl靜脈血，在漩渦混勻器上進(jìn)行混勻，在4 ℃避光條件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混勻室溫下避光8 min以使紅細(xì)胞充分裂解，離心分離(1500 r/min,5 min)，棄去上清液，加入PBS液1 ml進(jìn)行洗滌，以多聚甲醛液固定。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定樣本中CD4+T以及CD8+T淋巴細(xì)胞在CD3+T淋巴細(xì)胞中的比例。

1.2.2 NK細(xì)胞檢測(cè)：所有患者均于入住ICU時(shí)、機(jī)械通氣48 h及第7天抽取肘靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于實(shí)驗(yàn)管中加入20 μl鼠抗人特異性單抗(FITC-CD3和PE-CD56+CD16)，再加入100 μl新鮮靜脈血，在漩渦混勻器上進(jìn)行混勻，在4 ℃避光條件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混勻，室溫下避光8 min以使紅細(xì)胞充分裂解，離心分離(1500 r/min,5min)，棄去上清液，加入PBS液1 ml進(jìn)行洗滌，以多聚甲醛液固定，4 ℃固定30 min。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定樣本中NK 細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中占比。

1.2.3 危險(xiǎn)因素分析：對(duì)所有患者一般情況、實(shí)驗(yàn)室檢查、治療情況等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一般情況包括性別、年齡、住院時(shí)間、基礎(chǔ)疾病(糖尿病、冠心病、肺部基本疾病以及惡性腫瘤等)等。實(shí)驗(yàn)室檢查包括患者白蛋白水平、痰培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)等。治療情況包括抗生素使用情況(種類(lèi)和時(shí)間)、患者機(jī)械通氣時(shí)間、患者意識(shí)情況等。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者不同時(shí)間NK細(xì)胞比例比較 與對(duì)照組相比，研究組患者NK細(xì)胞比例在干預(yù)前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在第2天和第7天均顯著降低(P<0.05)；相比于干預(yù)前的基線值，第2天時(shí)兩組NK細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05)，第7天時(shí)兩組NK細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者不同時(shí)間NK細(xì)胞比例比較(%)

2.2 兩組患者不同時(shí)間T細(xì)胞亞群比較 與對(duì)照組相比，研究組患者CD4+T細(xì)胞比例在干預(yù)前、第2天和第7天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，CD8+T細(xì)胞占比在干預(yù)前和第2天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，第7天時(shí)顯著升高(P<0.05)；相比于干預(yù)前基線值，兩組患者CD4+T細(xì)胞占比在第2天和第7天均無(wú)明顯波動(dòng)(P>0.05)，兩組患者CD8+T細(xì)胞占比在第2天無(wú)明顯波動(dòng)(P>0.05)，研究組在CD8+T細(xì)胞占比第7天時(shí)升高顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者不同時(shí)間T細(xì)胞亞群比較(%)

2.3 ESBLs-VAP 危險(xiǎn)因素的單因素分析 患者性別、年齡和糖尿病不會(huì)使ESBLs-VAP風(fēng)險(xiǎn)增加(均P>0.05)；但患有肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平、患者意識(shí)障礙、機(jī)械通氣時(shí)間>5 d、應(yīng)激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數(shù)在兩組比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 兩組ESBLs-VAP單因素分析

2.4 ESBLs-VAP 危險(xiǎn)因素的多因素分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果，對(duì)肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平、患者意識(shí)障礙、機(jī)械通氣時(shí)間>5 d、應(yīng)激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數(shù)這幾種因素進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表5所示。表明肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平、患者意識(shí)障礙、機(jī)械通氣時(shí)間>5 d、應(yīng)激性高血糖、抗生素>2種可作為ESBLs-VAP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表5 ESBLs-VAP多因素回歸分析

3 討 論

隨著臨床上抗生素的廣泛使用，致病菌對(duì)抗β-內(nèi)酰胺類(lèi)菌藥物的耐藥性日益加重，特別是ESBLs細(xì)菌的產(chǎn)生，給臨床治療帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。ESBLs主要由大腸桿菌以及肺炎克雷伯菌產(chǎn)生，亦可由沙門(mén)菌屬、檸檬酸桿菌屬等細(xì)菌產(chǎn)生[9-11]。產(chǎn)ESBLs腸桿菌均能發(fā)生垂直傳播，同時(shí)ESBLs腸桿菌中的酶還能通過(guò)質(zhì)粒傳播給同科其他細(xì)菌，極容易導(dǎo)致交叉感染及耐藥菌擴(kuò)散，因此有必要對(duì)ESBLs菌所致VAP的機(jī)制進(jìn)行研究[12-13]。

本研究對(duì)ESBLs-VAP患者外周血中NK細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的占比進(jìn)行研究分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，研究組患者NK細(xì)胞比例在干預(yù)前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在第2天和第7天均顯著降低(P<0.05)；相比于干預(yù)前的基線值，第2天時(shí)兩組NK細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05)，第7天時(shí)兩組NK細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。NK細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)第一道防線，參與了機(jī)體適應(yīng)性免疫和固有免疫反應(yīng)，能在感染初期發(fā)揮重要的細(xì)胞毒效應(yīng)消滅靶細(xì)胞NK 細(xì)胞，也對(duì)不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞有殺傷作用，也可通過(guò)分泌 IFN-γ和TNF-α以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，再依靠與樹(shù)突狀細(xì)胞的交互作用使其向T細(xì)胞的抗原遞呈效應(yīng)增強(qiáng)，嚴(yán)重感染可引起外周血中NK細(xì)胞明顯減低[14]。

本研究對(duì)兩組CD4+T和CD8+T細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，研究組患者CD4+T細(xì)胞比例在干預(yù)前、第2天和第7天均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CD8+T細(xì)胞占比在干預(yù)前和第2天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第7天時(shí)顯著升高(P<0.05)；相比于干預(yù)前基線值，兩組患者CD4+T細(xì)胞占比在第2天和第7天均無(wú)明顯波動(dòng)(P>0.05)，兩組患者CD8+T細(xì)胞占比在第2天無(wú)明顯波動(dòng)(P>0.05)，研究組在CD8+T細(xì)胞占比第7天時(shí)升高顯著(P<0.05)。T細(xì)胞亞群以CD3+為代表，是重要的免疫細(xì)胞類(lèi)群，參與機(jī)體細(xì)胞免疫；輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞以CD4+為代表，抑制/細(xì)胞毒性T細(xì)胞以CD8+為代表，常用二者對(duì)免疫和感染性疾病的細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估[8]。危重癥患者術(shù)后存在創(chuàng)傷應(yīng)激狀態(tài)，患者免疫功能紊亂，出現(xiàn)免疫力下降，免疫應(yīng)答減弱，表現(xiàn)為CD4+T減少，CD8+T增加，進(jìn)而引起使免疫失衡，導(dǎo)致嚴(yán)重感染發(fā)生[15]。

本研究采用單因素分析對(duì)可能引起ESBLs-VAP的危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，結(jié)果顯示患者性別、年齡和糖尿病不會(huì)使ESBLs-VAP風(fēng)險(xiǎn)增加(P>0.05)；但患有肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平、患者意識(shí)障礙、機(jī)械通氣時(shí)間>5 d、應(yīng)激性高血糖、抗生素>2種、抗生素天數(shù)在兩組比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危險(xiǎn)因素。根據(jù)單因素分析結(jié)果，對(duì)上述幾種因素進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果表明肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平、患者意識(shí)障礙、機(jī)械通氣時(shí)間>5 d、應(yīng)激性高血糖、抗生素>2種可作為ESBLs-VAP的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?；颊叽嬖诘穆苑尾炕A(chǔ)疾病易引起肺部結(jié)構(gòu)和功能的改變，且因長(zhǎng)期使用抗生素等，免疫力低下，感染率增加。血清白蛋白降低表示患者營(yíng)養(yǎng)狀況較差，對(duì)呼吸系統(tǒng)肌肉功能有一定損害，增加呼吸衰竭及感染風(fēng)險(xiǎn)[16]。存在意識(shí)障礙的患者多有活動(dòng)受限，自主嗆咳反應(yīng)弱，易使口咽部及胃內(nèi)容物發(fā)生誤吸入肺內(nèi)，使ESBLs-VAP發(fā)生率明顯升高[17]。機(jī)械通氣會(huì)損傷呼吸道正常的防御功能，降低其細(xì)菌清除功能，易誘發(fā)肺部感染。應(yīng)激性高血糖使血液處于高滲狀態(tài)，引起血管通透性的改變，影響中性粒細(xì)胞的趨化、吞噬能力，增加ESBLs-VAP風(fēng)險(xiǎn)[18]。使用2種以上的抗生素易引起腸源性的感染，使腸道菌群失調(diào)，損傷腸道的屏障功能，使耐藥菌從多種途徑進(jìn)入呼吸道發(fā)生肺部感染[19]。

綜上所述，ESBLs-VAP的發(fā)生與NK細(xì)胞、T細(xì)胞亞群的改變有關(guān)，肺部基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平等因素是其獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。