彌婉軍，王曉娟

(1.渭南市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 渭南 714000；2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院腦病二科，陜西 寶雞 721000)

帕金森病是臨床上常見的神經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，好發(fā)于中老年人[1]。該病在臨床上主要表現(xiàn)為姿勢(shì)步態(tài)障礙、肢體僵直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩，病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的缺失，可導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量減少[2]。帕金森病的發(fā)病機(jī)制還不明確，但2型糖尿病與帕金森病互為發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因子，各自發(fā)病存在共同的病理變化[3-4]。腸促胰島素是可以使胰島素增敏的生長(zhǎng)因子家族，其中胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide 1，GLP-1)可通過增敏腦內(nèi)的胰島素信號(hào)受體實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用，其也可產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)、增殖，并且有利于前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化[5]。有研究顯示GLP-1蛋白經(jīng)腹腔給藥后可穿過血腦屏障進(jìn)入腦組織，在神經(jīng)元表面與相應(yīng)受體結(jié)合后，可激活下游信號(hào)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元分化與促進(jìn)神經(jīng)元突觸生長(zhǎng)[6]。Chi3l1基因在大腸、子宮、軟骨、腦組織、骨骼中都有廣泛表達(dá)，也為一種防御病原體結(jié)構(gòu)中的幾丁質(zhì)[7]?，F(xiàn)代研究表明Chi3l1具有雙重作用[8]，可在各種微生物引起的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。本文具體探討了GLP-1蛋白對(duì)帕金森病小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 36只8 周齡C57BL/6 雄性小鼠(15～20 g)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h晝夜循環(huán)光照，清潔動(dòng)物房環(huán)境安靜、溫度恒定(22±3)℃、濕度適宜(50%～55%)，自由飲食與飲水，每5 只小鼠居于1個(gè)籠內(nèi)。為使小鼠適應(yīng)環(huán)境，每只小鼠實(shí)驗(yàn)前均有1周適應(yīng)期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行操作。GLP-1/GIP雙受體激動(dòng)劑(DA3-CH)購(gòu)自美國(guó)BD公司，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)購(gòu)自武漢博士德公司，一抗與二抗購(gòu)自武漢三鷹公司，Chi3l1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工公司，利拉魯肽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 動(dòng)物分組 將所有小鼠隨機(jī)平分為三組：模型組、利拉魯肽組與GLP-1組。所有小鼠都給予建立帕金森病模型，通過腹腔給藥將20 mg/kg的MPTP 溶液注入小鼠體內(nèi)。30 min后模型組在建模過程中給予0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液注射，連續(xù)7 d。利拉魯肽組在建模過程中給予利拉魯肽腹腔注射25 nmol/(kg·d)，連續(xù)7 d。GLP-1組在建模過程中給予DA3-CH 腹腔注射25 nmol/(kg·d)，連續(xù)7 d。

1.3 觀察指標(biāo) ①在建模第1天與第7天進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，測(cè)定小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡能力，將小鼠放置于運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間為180 s、轉(zhuǎn)速20 r/min的滾輪上，記錄從轉(zhuǎn)軸開始轉(zhuǎn)動(dòng)到小鼠掉落所持續(xù)的時(shí)間。②在建模第1天與第7天進(jìn)行牽拉實(shí)驗(yàn),將小鼠雙前肢置于水平細(xì)繩上，可評(píng)定小鼠的四肢肌力。3分：四肢全都能夠抓緊細(xì)繩；2分：只有一個(gè)后肢可以抓緊細(xì)繩；1分：沒有后肢可以抓緊細(xì)繩；0分：無法抓緊細(xì)繩而掉落。③在建模后第7天處死小鼠，取眼球血1 ml左右，靜置30 min后4℃ 3000 r/min離心10 min，分離上層血清，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清Chi3l1含量。④取處死大鼠的腦組織，稱重后進(jìn)行裂解，置于組織研磨器內(nèi)，進(jìn)行充分研磨，12000 r/min離心10 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后在室溫下封閉2 h，在4 ℃溫育過夜的一抗(抗IBA-1抗體、抗GFAP抗體，1∶1000；抗β-actin抗體，1∶2000)，洗滌后進(jìn)行二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，洗滌后用Molecular Imager 顯現(xiàn)印跡，記錄目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組建模不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比 三組建模第7天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。見表1。

表1 三組建模不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(s)

2.2 三組建模不同時(shí)間點(diǎn)牽拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比 三組建模第7天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間牽拉肌張力評(píng)分都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。見表2。

表2 三組建模不同時(shí)間點(diǎn)牽拉實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比(分)

2.3 三組建模第7天血清Chi3l1含量對(duì)比 利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的血清Chi3l1含量低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。見表3。

表3 三組建模第7天血清Chi3l1含量對(duì)比(pg/ml)

2.4 三組建模第7天腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比 利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。見表4。

表4 三組建模第7天腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

3 討 論

帕金森病為臨床上的神經(jīng)退行性疾病之一，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為病理特征，在臨床上主要表現(xiàn)為姿勢(shì)平衡障礙、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)癥狀[9]。同時(shí)很多患者伴隨有抑郁、認(rèn)知功能障礙、睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，從而嚴(yán)重影響患者的身心健康[10]。MPTP是一種親脂性化合物，可以穿過血腦屏障；腹腔內(nèi)注射MPTP可建立帕金森病小鼠模型，也是基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用的小鼠模型。GLP-1是由小腸L細(xì)胞分泌的一種多肽激素，可以高效地通過血-腦屏障，可通過多環(huán)節(jié)機(jī)制發(fā)揮降糖作用，從而具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[11-12]。本研究顯示三組建模第7天的轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間、牽拉肌張力評(píng)分都低于建模第1天(P<0.05)，利拉魯肽組與GLP-1組高于模型組(P<0.05)，GLP-1組高于利拉魯肽組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，DA3-CH是GLP-1/GIP 雙受體激動(dòng)劑的一種，可介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的增殖，能促進(jìn)小鼠齒狀回神經(jīng)母細(xì)胞分化和神經(jīng)再生[13]。有研究給予野生型Sprague-Dawley大鼠GLP-1類似物，發(fā)現(xiàn)其可改善大鼠的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為能力，但此現(xiàn)象可以被GLP-1拮抗劑逆轉(zhuǎn)[14]。

Chi3l1基因位于染色體1q32.1上一個(gè)高度保守的區(qū)域，含有10個(gè)外顯子，與IL-6受體基因(1q21)，與CRP基因(1q21-1q23)位于1號(hào)染色體的同一臂上。Chi3l1基因啟動(dòng)子序列包括多種調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn)，但是也具有多個(gè)突變位點(diǎn)。已有研究顯示Chi3l1基因啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)單核苷酸多態(tài)性與機(jī)體的氧化應(yīng)激水平相關(guān)，基因突變位點(diǎn)發(fā)生變化時(shí)，可增強(qiáng)Chi3l1基因與CCATT 序列增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的結(jié)合力，而后者具有轉(zhuǎn)錄活化作用，從而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[15]。本研究顯示利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的血清Chi3l1含量低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，帕金森病能夠造成小鼠氧化應(yīng)激損傷，GLP-1蛋白治療能夠抑制Chi3l1的釋放，從而具有預(yù)防氧化應(yīng)激損傷的作用[16]。當(dāng)前有研究也顯示DA3-CH可呈劑量依賴性保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞過氧化氫介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減少自由基的釋放[17]。

IBA-1 特異性表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，其也屬于一種鈣結(jié)合蛋白，是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。GFAP 參與細(xì)胞骨架構(gòu)成，其作為一種中間絲狀蛋白，要存在于星型膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)[18]。帕金森病可導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)障礙，導(dǎo)致IBA-1 與BDNF 的廣泛釋放，也使得膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖程度降低，可激活神經(jīng)炎癥反應(yīng)[19-20]。本研究顯示利拉魯肽組與GLP-1組建模第7天的腦組織IBA-1、GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，GLP-1組低于利拉魯肽組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，DA3-CH能神經(jīng)元的損傷程度降低，間接減少小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖，從而抑制IBA-1、GFAP蛋白的表達(dá)。本研究也存在一定不足，沒有進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，也沒有進(jìn)行劑量學(xué)分析，將在后續(xù)研究中進(jìn)行探討。

總之，GLP-1蛋白在帕金森病小鼠的應(yīng)用能緩解氧化應(yīng)激損傷，抑制血清Chi3l1與腦組織IBA-1、GFAP蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。