王 悅，王一妹，王勝軒，郭加璇，李世杰，馬興紅

（東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

小鼠早期妊娠通常是指妊娠第1～8 天，交配次日可見的陰道栓代表著雌雄小鼠成功交配，小鼠胚胎著床發(fā)生在妊娠第5 天，成功著床需要具有著床能力的胚胎與接受態(tài)子宮建立密切的相互作用聯系[1-3]，胚胎著床對于胚胎進一步的發(fā)育和成功妊娠至關重要。著床后，囊胚周圍的梭形子宮內膜基質細胞迅速增殖并分化為上皮樣分泌蛻膜細胞，這一過程稱為蛻膜化。蛻膜基質細胞在保護胚胎免受局部母體免疫排斥、為生長胚胎提供營養(yǎng)、調節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲和胎盤形成等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。

彈性蛋白（Elastin）是細胞外基質蛋白的重要成員之一，由Eln基因編碼，可與微纖維結合形成彈性纖維，進而賦予了組織一定的彈性回縮功能和可逆的變形能力[7-9]。有研究報道，彈性蛋白是肺部發(fā)育所必需的，Eln-/-基因型的小鼠出生時肺的遠端氣道發(fā)育受損而形成異常大的空腔[10-11]。彈性蛋白和其衍生肽也可調節(jié)平滑肌細胞的行為，促進健康血管的維持[12]。研究發(fā)現，彈性蛋白在維持正常的雌性生殖器官等生理功能上具有重要作用，其功能受損將導致盆底功能障礙性疾病的發(fā)生[13]。但有關Elastin在小鼠早期妊娠子宮中的表達和功能未見報道，本研究利用原位雜交和熒光定量PCR 方法檢測了Elastin在早期妊娠、假孕及人工誘導蛻膜化模型小鼠子宮中的表達，進而探究Elastin的作用，為研究Elastin在大動物妊娠過程中的作用機制提供理論依據，對于提高畜牧動物繁殖率具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗中所采用的模式動物為性成熟、6～10 周齡的ICR 品系的小白鼠，由實驗室統(tǒng)一購買于黑龍江中醫(yī)藥大學。小鼠在室溫22～24℃、濕度適合的人工飼養(yǎng)條件下成長，光照與黑暗循環(huán)交替（其中光照時間為07:00—19:00），在人工控制下飼料及飲水自由獲取。

1.2 實驗動物模型

1.2.1 早期妊娠模型 挑選若干只已滿6 周齡性成熟的且正處于發(fā)情期、體征健康的雌性小鼠，按2:1 的比例于16:00 左右，與健康雄鼠合籠交配，在次日08:00 左右檢栓，若陰道口出現白色栓塊堵塞，則說明兩者已成功交配，當天即記作該鼠早期妊娠的第1 天。按照此合籠檢栓的方式，分別取材妊娠第1～8 天的小鼠子宮組織（每天取3 只），取妊娠第1～4 天子宮時，生理鹽水沖輸卵管或子宮以確定妊娠的發(fā)生；取妊娠第5 天子宮時，靜脈注射0.1 mL 1%芝加哥天藍染料，以確定小鼠胚胎著床位點；取妊娠第6～8 天子宮時，子宮有若干明顯凸起，便可確定妊娠的發(fā)生，將組織經液氮速凍后放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 假孕模型 挑選若干只6～8 周體征健康的雄性小鼠，進行結扎手術切除其雙側輸精管，術后恢復2～3 周后，然后讓其按1:2 比例與性成熟的發(fā)情期雌性小鼠合籠交配，在次日08:00 左右檢栓以確認是否成功交配，若陰道口出現白色栓塊堵塞，則把當天記作該鼠假孕第1 天，按此方式分別取假孕第1～5 天的小鼠子宮組織，每組取材3 只，于-80℃冰箱凍存。

1.2.3 人工誘導蛻膜化模型 取3 只假孕第4 天的雌鼠，用犬眠寶將其麻醉后，一側子宮角注射25 μL 芝麻油以誘導蛻膜化，而另一側子宮角不做任何處理，作為對照組。在假孕第8 天時，將小鼠處死，取子宮材料，于-80℃冰箱凍存。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠Elastin基因片段克隆及探針的制備 從NCBI 數據庫中獲取小鼠Elastin基因的全mRNA 序列（NM-007925.4）。然后，根據基因序列，使用Primer 5 軟件和NCBI 設計引物（上游引物5'-GAAAACCCACA GGACAAGGA-3'；下游引物5'-TAATGGGAGTCAGGG ACAGG-3'），設計的PCR 目的產物長度為401 bp。以小鼠子宮cDNA 為模板，PCR 擴增目的片段，采用Promega 的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒膠回收PCR 產物，然后連接到pGEM-T 載體上，轉化重組質粒于DH5α感受態(tài)細胞中，在超凈工作臺中隨機挑取若干菌落，進行菌落PCR，對連接方向正確的菌落進行搖菌，用Axygene 質粒小提試劑盒提取質粒DNA，送哈爾濱擎科生物技術有限公司進行測序，以測序正確的質粒為模板進行PCR 擴增并純化PCR 產物，利用Roche 公司的DIG RNA labeling kit 試劑盒對cRNA 片段進行地高辛標記。

1.3.2 原位雜交 將組織厚度為8 μm 的冰凍切片置于55℃的展片臺上烘干，在4%多聚甲醛（PFA）中固定1 h，洗滌后于Triton X-100 溶液中透膜處理20 min，洗滌，室溫預雜交15 min，棄預雜交液，配含有ElastincRNA 探針的雜交液，滴加于切片上，55℃雜交過夜；次日，在55℃水浴下，分別用含有50% 甲酰胺的2×檸檬酸鈉緩沖液（SSC）洗滌切片15 min、2×SSC 洗滌30 min、0.2×SSC 洗滌30 min 2 次，在室溫下，用不含甲酰胺的0.2×SSC 溶液洗滌5 min，Buffer 1 溶液清洗5 min 后滴加封閉液（HB）于切片上，封閉60 min 后滴加地高辛標記的堿性磷酸酶抗體，4℃過夜；第3 天，在室溫下用Buffer 1 溶液清洗切片5 min 3 次，Buffer 2 溶液清洗5 min，滴加堿性磷酸酶顯色液于切片上，出現信號后用甲基綠對染、封片及照相。

1.3.3 實時熒光定量PCR 本步驟采用TRIZOL（Invitrogen）提取小鼠子宮組織的總RNA，Nano Drop 2000（Thermo）測RNA 濃度，應用Promega 公司的GoScript Reverse Transcription Mix 反轉錄試劑盒，參照其說明書將RNA 反轉錄成cDNA，使用TaKaRa 公司的熒光定量PCR（TB GreenTMPremix Ex TaqTM） 試劑盒，以cDNA 為模板進行PCR，Elastin（NM-007925.4）引物序列：上游引物5'-GATGGTGCACACCTTTGTTG-3'，下游引物5'-CCGGTATTTGGGTACCAATG-3'，內參基因RpL7（M29016）上游引物：5'-GCAGATGTACCGCA CTGAGATTC-3'，下游引物：5 '-ACCTTTGGGCTTACT CCATTGATA-3'，反應體系10 μL：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，Rox Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL，dH2O 3.4 μL。該反應采用Amplied Biosystems?7500 Real-Time PCR System（Amplied Biosystems）系統(tǒng)，反應條件：95℃30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40 個循環(huán)后收集熒光信號。利用2-ΔΔCt法來分析目的基因的相對表達。

1.3.4 統(tǒng)計分析 采用 GraphPad Prism 6.0 軟件繪圖并分析數據。差異性比較采用單因素方差分析或t 檢驗，統(tǒng)計學意義為P＜0.05。

2 結果

2.1ElastinmRNA 在小鼠早期妊娠子宮中的表達 原位雜交結果顯示，ElastinmRNA 在小鼠早期妊娠第1～4天子宮中沒有表達，隨著妊娠的進行，ElastinmRNA在第5～8 天的子宮壁肌層表達，并逐漸增強，其中ElastinmRNA 在第7、8 天的系膜側蛻膜區(qū)也有較強的表達（圖1-A）。熒光定量PCR 結果表明，與早期妊娠1～4 d 相比，ElastinmRNA 在5～8 d 小鼠子宮中顯著表達，且相對表達量逐漸增加（圖1-B）。

2.2ElastinmRNA 在小鼠假孕模型子宮中的表達 原位雜交結果表明，在假孕第1～4 天子宮中，未檢測到ElastinmRNA 的表達（圖2-A～E），這一表達模式與正常妊娠時類似，但在假孕第5 天子宮中未檢測到ElastinmRNA 的表達（圖2-F）。

圖1 ElastinmRNA 在小鼠早期妊娠子宮中的表達

圖2 ElastinmRNA 在小鼠假孕模型子宮中的表達

2.3ElastinmRNA 在小鼠人工誘導蛻膜化子宮中的表達原位雜交結果顯示，ElastinmRNA 在人工蛻膜子宮中的肌層及系膜側的蛻膜區(qū)域有很強的表達（圖3-A），而在對照子宮中，僅在肌層處檢測到微弱的ElastinmRNA 表達（圖3-B）。

圖3 ElastinmRNA 在小鼠人工誘導蛻膜化子宮中的表達

3 討 論

彈性蛋白是彈性纖維的主要成分，它的存在使得動物機體具有組織擴張以及緩沖等能力，彈性蛋白所維持的彈性纖維在不同組織器官中具有不同的形態(tài)結構[8]。有研究表明，彈性蛋白廣泛分布于人子宮肌層和血管平滑肌中，其中在血管周圍組織中也有表達[14]。子宮肌層在小鼠妊娠過程中起重要作用，從胚胎定位及胚胎著床一直到分娩啟動，子宮肌層都扮演著重要的角色。在小鼠早期妊娠第1～4 天，子宮收縮一方面促進精子通過子宮到達輸卵管受精，另一方面受精后的胚胎在妊娠第4 天到達子宮后，子宮收縮有利于胚胎在子宮中的分布。胚胎著床發(fā)生在妊娠第5 天，肌層收縮在胚胎著床后被抑制對妊娠的維持非常重要，這一過程通過多方面的激素調節(jié)。在哺乳動物妊娠中，孕酮受體（PR）和孕酮（P4）通過抑制收縮相關基因催產素受體（OXTR）、環(huán)氧合酶2（COX-2）等在肌層中的表達來維持子宮靜止狀態(tài)[15]。本實驗發(fā)現，Elastin在小鼠早期妊娠第1～4 天子宮中檢測不到表達，在胚胎著床后的妊娠第5 天開始表達，第6～8 天子宮肌層有強烈的表達，且表達量逐漸上升，這一結果說明，Elastin參與小鼠早期妊娠子宮肌層彈性的調控，Elastin的表達可能有助于著床后植入胚胎的穩(wěn)定。與正常妊娠結果不同的是，Elastin在小鼠假孕第5 天子宮中不表達，在假孕過程中的激素水平與正常妊娠時基本相同，不同的是假孕第5 天沒有發(fā)生胚胎著床，這提示Elastin可能受著床的胚胎或胚胎著床后誘導的蛻膜分泌的因子調控，通過調控子宮肌層的收縮活動參與妊娠后期維持子宮相對平靜的內環(huán)境，維持妊娠進行。

在胚胎著床啟動后，子宮基質細胞開始發(fā)生蛻膜化[16-17]。蛻膜化過程十分復雜，這一過程涉及到許多生物學事件，包括子宮基質細胞生長、基質成纖維細胞再分化、細胞外基質重建、細胞凋亡等[17-18]。分化后的子宮基質細胞對于母體子宮的重塑、血管的發(fā)育起到了有力的支持作用，也為后期胚胎的正常發(fā)育提供了保障[18-19]。本研究發(fā)現，Elastin不但在小鼠妊娠第7～8 天的子宮肌層中表達，還高表達于系膜側的蛻膜區(qū)中。在假孕子宮腔內注射少量芝麻油可誘導嚙齒動物發(fā)生蛻膜化[20]。這種人工誘導的蛻膜組織稱為蛻膜瘤，它與妊娠期間形成的正常蛻膜組織相似。同樣，Elastin也高表達于人工蛻膜子宮的肌層及系膜側蛻膜區(qū)域。子宮系膜側是一個不太致密的區(qū)域，對血管形成和胎盤的發(fā)育很重要[21]。以上結果說明，Elastin參與小鼠子宮蛻膜化過程，與胎盤的發(fā)育相關。

有研究表明，雌激素會影響彈性蛋白基因表達使其發(fā)生相關變化，人陰道壁成纖維細胞受到應力牽拉下，ElastinmRNA 表達量增多，對受應力后的細胞加入雌二醇，進一步促進了ElastinmRNA 的表達[13]。Lin 等[22]證明TGF-β1 可上調大鼠尿道細胞中ElastinmRNA 的表達，而雌激素干擾TGF-β1 信號通路可抑制彈性蛋白的表達，導致彈性纖維在尿道中的不當組裝。也有科學家利用小雞血管平滑肌細胞證明，肝素對增殖細胞中Elastin表達的上調是通過抑制蛋白激酶C 活性來介導的[23]。Kuang 等[24]證明，在大鼠新生肺成纖維細胞中，白細胞介素1β（IL-1β）可激活NF-κB，從而下調ElastinmRNA 的表達。NF-κB 的激活是IL-1β誘導彈性蛋白啟動子轉錄活性下調所必需的。在人肺成纖維細胞中，TGF-β依賴于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信號激活Elastin的轉錄[25]。綜上所述，在不同類型的細胞中，多種調節(jié)因子均可通過不同方式調控Elastin的表達，然而，關于Elastin在小鼠早期妊娠子宮肌層及蛻膜細胞中的表達受何種分子的調控，值得進一步研究。

一直以來，畜牧動物繁殖性能的高低是養(yǎng)殖行業(yè)面臨的重要問題，較低的著床率、產仔率以及較高流產率都是導致其繁殖力低下的主要原因，這給畜牧業(yè)帶來巨大的經濟損失。本研究首次揭示了Elastin在小鼠早期妊娠中的表達規(guī)律，證明Elastin在小鼠妊娠子宮壁肌層彈性的調控與蛻膜化過程中發(fā)揮重要作用，Elastin可能通過調控子宮肌層的收縮活動參與妊娠后期維持子宮相對平靜的內環(huán)境，進而維持妊娠的進行，防止了流產現象的發(fā)生，這一研究為后續(xù)在家畜中的研究奠定了實驗基礎，對于畜牧動物繁殖率的提高及治療等具有重要的理論意義和潛在的經濟價值。

4 結 論

本實驗結果表明，ElastinmRNA 在小鼠早期妊娠第6 天的子宮壁肌層及第7、8 天的肌層和蛻膜區(qū)強表達，在人工誘導蛻膜子宮中肌層和系膜側蛻膜區(qū)強表達。Elastin很可能參與調控小鼠早期妊娠子宮壁肌層的彈性及蛻膜化過程，進而在小鼠早期妊娠過程中發(fā)揮作用。