李俊玲，郭麗榮，郭田燕，秦 健，杜 榮*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗教學(xué)中心，山西太谷 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

應(yīng)激最早由加拿大病理學(xué)家Hans Selye 提出，指動物機體在受到外界各種不良刺激時發(fā)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)[1]。營養(yǎng)應(yīng)激是由于外界特殊的營養(yǎng)環(huán)境（營養(yǎng)過高或過低）導(dǎo)致細胞代謝失衡甚至紊亂而發(fā)生的應(yīng)答反應(yīng)[2]。營養(yǎng)應(yīng)激中研究較多的是營養(yǎng)剝奪應(yīng)激，禁食是一種慢性的營養(yǎng)不足，是指在8～12 h 或幾天內(nèi)不攝入或攝入很少的熱量[3-4]。ATF3（Activating Transcription Factor 3）是cAMP-CREB 轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，它可以被多種應(yīng)激誘導(dǎo)表達[5]。ATF3 包含一個堿基區(qū)亮氨酸拉鏈（bZIP）結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與CREB或AP-1 順式調(diào)節(jié)元件結(jié)合，可根據(jù)細胞環(huán)境抑制或激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[6-7]。在多種應(yīng)激條件下，ATF3 會通過表達改變而發(fā)揮其作用。有研究表明，運動后小鼠骨骼肌ATF3表達量明顯升高[8]。ATF3 可防止應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠造血干細胞衰竭[9]。ATF3 可參與斑馬魚視神經(jīng)的再生，在斑馬魚脊髓損傷后12 h 和6 d 其mRNA 水平會明顯升高[10-11]。多項研究表明，在營養(yǎng)應(yīng)激條件下肝臟ATF3 的表達會發(fā)生顯著改變。與未修改豆油組相比，給大鼠喂養(yǎng)含有10%的酯化豆油8 周后，其肝臟ATF3基因表達量升高[12]。通過比較新孵化小雞禁食48 h 和禁食后再喂養(yǎng)48 h 的肝臟轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，后者ATF3 表達量更高[13]。禁食48 h 后再喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料后的前17 h，小鼠肝臟中ATF3基因表達升高；禁食46 h 后再喂養(yǎng)含有α-淀粉或葡萄糖的瓊脂凝膠14 h，小鼠肝臟中ATF3基因表達量增加[14-15]。目前有關(guān)家畜ATF3 的研究相對較少。有研究表明，ATF3基因在延邊黃牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、后腿肌、眼肌、西冷、上腦和皮下脂肪10 個部位組織中均有表達，可能影響機體的脂肪沉積[16]。目前，針對綿羊ATF3 的研究還鮮見報道。因此，本實驗旨在對綿羊ATF3 的結(jié)構(gòu)和特性進行一系列生物信息學(xué)分析，并通過qRT-PCR 檢測禁食條件下ATF3mRNA 的表達，利用Genomatix 軟件預(yù)測ATF3啟動子區(qū)調(diào)控元件，以了解綿羊ATF3 的分子特性并探討ATF3基因在綿羊營養(yǎng)剝奪應(yīng)激條件下的表達變化及可能的表達調(diào)控原因，為進一步深入研究綿羊ATF3基因的表達調(diào)控及作用機制并發(fā)掘其應(yīng)用潛能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 本實驗選用6 月齡、體重45 kg左右的6 只母羊，隨機分為正常組和禁食組，正常組常規(guī)飼養(yǎng)，禁食組禁食3 d。3 d 后分別采集6 只綿羊大腿部位的半腱肌組織，并迅速放于液氮中儲存。

1.2 主要儀器 電子分析天平產(chǎn)自奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；超凈工作臺產(chǎn)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；核酸蛋白濃度測定儀產(chǎn)自美國Thermo 公司；電泳儀電源、電泳槽產(chǎn)自北京六一儀器廠；96 孔溫度梯度PCR 儀、熒光定量PCR 儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)均產(chǎn)自美國BIO-RAD 公司。

1.3 綿羊ATF3 蛋白的生物信息學(xué)分析 從NCBI 網(wǎng)站上下載綿羊ATF3 的蛋白序列，利用表1 中的生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件對其進行分析。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 將綿羊骨骼肌置于裝有液氮的研缽中進行充分研磨，研磨后加入RNAiso Plus（TaKaRa）進行總RNA 提取。取少量RNA 進行核酸電泳檢測，鑒定RNA 是否降解，用核酸濃度測定儀檢測RNA 濃度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄。第一步需要先去除基因組DNA，反應(yīng)體系和條件：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 4 μL，RNase Free dH2O 補至10 μL；42℃ 2 min，4℃ 2 min。第二步為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件：步驟一反應(yīng)液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 補至20 μL；37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 2 min。之后用核酸濃度測定儀檢測反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 濃度。

1.5 引物設(shè)計及合成 通過NCBI 上的Primer-BLAST設(shè)計引物（表2），送至北京華大科技有限公司合成。

1.6 qRT-PCR 將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 稀釋為100 ng/μL，以稀釋后的cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系和條件：TB Green Premix Ex Taq II（2×）5 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL、DNA 模板 1 μL，滅菌水補足至10 μL；預(yù)變性95℃ 2 min，PCR 反應(yīng)95℃ 30 s、65℃ 34 s 共40 個循環(huán)。每組3 個動物樣本，每個樣本重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計分析 利用2-ΔΔCT算法分析實時熒光定量PCR結(jié)果。運用SPSS 21.0 軟件中獨立樣本T 檢驗進行方差分析。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。運用GraphPad Prism 8 制作柱狀圖。

1.8 綿羊ATF3基因啟動子區(qū)調(diào)控元件的分析 從NCBI上下載綿羊ATF3基因啟動子區(qū)序列，運用Genomatix 軟件中的Matlnspector 分析其調(diào)控元件及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。

表1 分析綿羊ATF3 蛋白結(jié)構(gòu)特征的生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件

表2 內(nèi)參和目的基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊ATF3 的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 綿羊ATF3 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果 運用ProtParam在線網(wǎng)站對綿羊ATF3 蛋白理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示該蛋白氨基酸殘基數(shù)為187，分子質(zhì)量為21 303.58，分子式為C920H1521N273O282S12，原子總數(shù)為3 008，理論等電點為8.89。帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為26，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為31。不穩(wěn)定系數(shù)是71.73，把該蛋白歸為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為78.77，總平均疏水性值為-0.630。

2.1.2 綿羊ATF3 蛋白亞細胞定位和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 運用PredictProtein 在線網(wǎng)站分析綿羊ATF3 蛋白的亞細胞定位，可以看出綿羊ATF3 蛋白定位于細胞核，說明該蛋白主要在細胞核行使功能（圖1A）。運用SOPMA 在線網(wǎng)站預(yù)測綿羊ATF3 蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α螺旋有100 個，占53.48%；β折疊有15 個，占8.02%；β轉(zhuǎn)角有11 個，占5.88%；無規(guī)則卷曲有61 個，占32.62%（圖1B）。運用SWISS-MODEL 在線網(wǎng)站預(yù)測綿羊ATF3 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白三級結(jié)構(gòu)α螺旋和無規(guī)則卷曲居多（圖1C），與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。

圖1 綿羊ATF3 蛋白亞細胞定位和結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.3 綿羊ATF3 蛋白三級結(jié)構(gòu)的評估結(jié)果 運用SAVES 在線網(wǎng)站評估綿羊ATF3 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示殘基在[A,B,L]區(qū)域占比100%，在[a,b,l,p]區(qū)域、[～a,～b,～l,～p]區(qū)域和無標(biāo)記區(qū)域（不允許圓點出現(xiàn)的區(qū)域）都為0（圖2）。通常評估的判定標(biāo)準(zhǔn)是[A,B,L]區(qū)域達到90% 以上便認為三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測質(zhì)量較高，可見本實驗預(yù)測的綿羊ATF3 蛋白三級結(jié)構(gòu)質(zhì)量良好。

圖2 綿羊ATF3 三級結(jié)構(gòu)的拉式構(gòu)象圖

2.1.4 綿羊ATF3 蛋白疏水性和磷酸化位點分析結(jié)果運用ProtScale 在線網(wǎng)站分析綿羊ATF3 蛋白的疏水性（圖3A），結(jié)果顯示在第24 位氨基酸（Ala）處分值最大，為1.756，表明該區(qū)域為高疏水性區(qū)域；在第97和98 位氨基酸（Arg 和Arg）處分值最小，為-4.144，該區(qū)域為高親水性區(qū)域。運用KinasePhos 在線網(wǎng)站分析綿羊ATF3 的磷酸化位點，結(jié)果顯示該蛋白存在3 個絲氨酸位點和2 個蘇氨酸位點（圖3B）。

圖3 綿羊ATF3 蛋白疏水性（A）和磷酸化位點（B）分析

2.1.5 綿羊ATF3 氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果 運用DNAStar 軟件分析綿羊ATF3 氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，綿羊ATF3 氨基酸序列與山羊（XP_017916237.1）、牛（XP_010811857.1）、豬（XP_020919512.1）、兔（XP_008266664.1）、獼猴（NP_001252939.1）、人（NP_001025458.1）、大鼠（NP_037044.1）、小鼠（NP_031524.2）、雞（XP_015139364.1）、斑馬魚（NP_957258.1）相應(yīng)序列之間的同源性分別為100%、98.4%、99.5%、97.8%、97.8%、97.3%、96.2%、96.2%、86.3%、72.9%（圖4A）。進化樹顯示綿羊ATF3與牛、山羊、豬處于同一分支（圖4B），表明其親緣關(guān)系相近。

圖4 綿羊ATF3 氨基酸序列同源性（A）及系統(tǒng)進化樹（B）分析

2.2 熒光定量分析結(jié)果 對正常組和禁食組綿羊肌肉ATF3mRNA 的表達進行實時熒光定量檢測，結(jié)果顯示相對于正常組，禁食組ATF3mRNA 表達量極顯著降低了92.33%（圖5）。

圖5 正常組和禁食組綿羊肌肉ATF3mRNA 表達水平

2.3 綿羊ATF3啟動子區(qū)調(diào)控元件的分析 Matlnspector分析綿羊ATF3基因啟動子區(qū)，結(jié)果顯示綿羊ATF3基因2 kb 啟動子區(qū)存在許多調(diào)控元件，其中包括與應(yīng)激相關(guān)的多種元件，如CREB、NFKB、AP1 和GRE 等（表3）。

3 討 論

本研究分析表明，綿羊ATF3 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是71.73，歸為不穩(wěn)定蛋白，這為進一步研究中構(gòu)建重組載體時需要通過融合特定標(biāo)簽或替換特定氨基酸等措施來增加ATF3 的穩(wěn)定性提供了啟示。亞細胞定位結(jié)果顯示綿羊ATF3 蛋白位于細胞核，符合ATF3 作為轉(zhuǎn)錄因子的功能特點。大部分核定位信號的共同特征是含有起關(guān)鍵作用的堿性氨基酸，例如Lys-和Arg-[17]，而綿羊ATF3 氨基酸序列第94～99 位（RKKRRR）剛好富含Lys-（縮寫K）和Arg-（縮寫R），所以推測綿羊ATF3 蛋白定位于細胞核可能與其具有核定位信號有關(guān)。綿羊ATF3 氨基酸序列與山羊、牛、豬、兔、獼猴、人、大鼠和小鼠相應(yīng)序列之間的同源性均超過95%，說明ATF3基因編碼序列在不同物種間具有較高的保守性和一定的變異性，這為進一步通過比較不同物種間ATF3的功能和結(jié)構(gòu)差異來鑒定發(fā)揮特異性作用的氨基酸位點提供了部分依據(jù)。

ATF3 在應(yīng)激刺激下形成二聚體激活或抑制靶基因表達，可調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化形成、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生等代謝或與代謝相關(guān)的過程[5,18]。高密度脂蛋白具有抗動脈粥樣硬化的作用，可誘導(dǎo)ATF3 的表達[19]。ATF3在肝臟中的表達可以通過抑制糖異生導(dǎo)致葡萄糖穩(wěn)態(tài)缺陷[20]。低葡萄糖可以誘導(dǎo)胰島α細胞和β細胞ATF3基因的表達，而上調(diào)的ATF3能提高胰高血糖素的轉(zhuǎn)錄，但不能提高胰島素的轉(zhuǎn)錄[21]。然而，本研究中，禁食組綿羊ATF3mRNA 表達量極顯著降低，與上述ATF3調(diào)節(jié)糖代謝的作用模式似乎并不一致，這可能與反芻動物特有的糖代謝機制有關(guān)，確切原因需要進一步深入研究。

表3 綿羊ATF3 啟動子區(qū)調(diào)控元件和位點分析

啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的分析可以為研究ATF3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供依據(jù)。Liang 等[22]和Hai[23]對人ATF3 5'端啟動子區(qū)域的序列分析顯示有大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如AP-1、ATF/CRE、NF-KB。對綿羊ATF3基因啟動子區(qū)的分析也發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控元件，其中部分元件如CREB、NFKB、AP1 和GRE 等及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在其他物種的一些研究中被證明與應(yīng)激有關(guān)。在應(yīng)激條件下，大鼠海馬神經(jīng)元中CREB 的磷酸化水平發(fā)生變化[24]。在LPS、poly I:C、CpG-DNA、PGN 或不同濃度嗜水氣單胞菌處理的各種刺激下，日本鰻魚肝臟細胞IKKα表達顯著增強，而IKKα表達又可顯著誘導(dǎo)NF-KB 和AP-1 表達上調(diào)[25]。Xu 等[26]研究表明，PM2.5 暴露可誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞中AP-1 及其組分c-Jun 和ATF2 的激活。糖皮質(zhì)激素（GCs）參與調(diào)節(jié)許多生理過程，如炎癥、代謝和應(yīng)激反應(yīng)，主要通過與其同源受體GR 結(jié)合，之后GC-GR 再結(jié)合于靶基因的GRE 或nGRE 元件，發(fā)揮正向或負向調(diào)節(jié)作用[27]。哺乳動物和斑馬魚等多種生物已被證實在應(yīng)激條件下會分泌GCs，通過GC-GR-GRE 途徑來調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[28-29]。由此可以推測，CREB、NFKB、AP1 和GRE 等元件與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合可能是介導(dǎo)綿羊營養(yǎng)剝奪后骨骼肌ATF3表達下調(diào)的部分原因。這一復(fù)雜的調(diào)控機制亟待進一步深入系統(tǒng)地研究證實。

4 結(jié) 論

本研究通過生物信息學(xué)軟件對綿羊ATF3基因的分子特性及啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行了分析預(yù)測，且通過定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)禁食條件下綿羊ATF3mRNA 的表達顯著下降，為進一步深入研究ATF3基因的表達調(diào)控及作用機制奠定了基礎(chǔ)。