沈濤濤 ，張佳蘭，吳 艷，程詩彬，皮勁松，黃竹林，王孝忠

（1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；3.武漢民族科技飼料有限公司，湖北武漢 430223；4.湖北省宜昌市動物疫病預防控制中心，湖北宜昌 443005）

蛋殼品質(zhì)是蛋雞生產(chǎn)性狀的重要組成部分。已有研究表明，在日常消費中，人們對雞蛋及其相關產(chǎn)品都具有極高的消費欲望[1]。蛋殼質(zhì)量是雞蛋品質(zhì)的重要評價指標之一，對蛋雞產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益有直接影響[2]。角蛋白14 屬于富含半胱氨基酸殘基的I 型（酸性）角蛋白，參與構成上皮細胞的骨架，且KRT14基因有參與細胞生長，促進細胞分化的功能。Petek 等[3]、Confalonieri等[4]研究表明，KRT14與中間絲纖維蛋白有親緣關系，是人類癌癥發(fā)生、發(fā)展的上皮性標記物；Jankowski 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，KRT14表達量與人的單純型大皰性表皮松解癥、肺損傷等病狀密切相關。然而，關于KRT14基因在蛋雞上的研究未見報道。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)KRT14基因在蛋殼強度和蛋殼厚度表現(xiàn)極端的2 個群體中表達存在顯著差異。另外，江漢雞是湖北省分布最廣蛋肉兼用型地方雞品種，體型較小，采食少，生長速度慢，具有適應能力強、耐粗飼、產(chǎn)蛋較多、肉質(zhì)細嫩、味美等特點[6]。因此，本實驗以江漢雞為研究對象，分析KRT14基因的SNP 標記及其單倍型組合與蛋雞蛋殼品質(zhì)性狀的相關性，以期找到與雞蛋蛋殼品質(zhì)性狀相關的分子標記，為培育具有優(yōu)良蛋殼品質(zhì)性狀的蛋雞品種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集 漢江雞樣本來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗場。選取相同管理環(huán)境、健康的43 周齡的產(chǎn)蛋江漢母雞414 只，翅靜脈采血，用ACD（酸性檸檬酸葡萄糖）抗凝劑抗凝后冷凍保存。采集每個個體連續(xù)3 d 所產(chǎn)的蛋，測定每個蛋的蛋重、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋黃重等性狀。

1.1.2 指標測定與方法 利用電子天平對蛋重進行測定蛋重。利用游標卡尺分別測定蛋殼鈍端、中間和銳端部位3 個點的蛋殼厚度（剝離蛋殼膜后），計算平均值為蛋殼厚度。采用蛋殼強度分析儀（NFN388，日本FHK公司）進行測定蛋殼強度。

1.2 DNA 提取 雞基因組DNA 利用北京百泰克生物技術有限公司生產(chǎn)的基因組DNA 試劑盒（按試劑盒說明書操作）提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用微量紫外分光光度計測定濃度，用超純水稀釋所有樣品終濃度為100 ng/μL。

1.3 引物設計與PCR 擴增 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫公布的雞KRT14基因cDNA 序列（登錄號Gene ID：NM_00100 1311.2），利用Primer 5.0 設計3 對引物擴增KRT14基因編碼區(qū)。引物序列見表1。引物由北京奧科生物技術有限公司合成。

以提取的雞基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。20 μL 擴增體系：2×Taq PCR mix 10 μL，上、下游引物 各0.5 μL（10 μmol/L），DNA 模 板1 μL，加超純水補足至20 μL。反應條件：94℃ 2 min；94℃ 15 s、55℃ 30s、68℃ 90s，共35 個循環(huán)，68℃ 10 min。

1.4 測序 利用設計KRT14基因的3 對引物在江漢雞群體中進行SNPs 突變位點篩選，將擴增獲得的PCR產(chǎn)物利用濃度為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由北京奧科生物技術有限公司進行測序。

1.5 序列分析 利用DNA Star 軟件進行測序結(jié)果的比對分析；利用Haploview 軟件分析不同多態(tài)性位點的單倍型，利用PHASE 軟件分析不同位點間的連鎖不平衡。

1.6 統(tǒng)計分析 利用Excel 軟件計算各突變位點的基因型頻率、等位基因頻率及哈代-溫伯格平衡檢驗。采用SPSS 18.0 軟件一般線性模型中的One-Way ANOVA 進行不同位點基因型與表型之間的關聯(lián)分析，結(jié)果以平均值± 標準差表示。模型：Yij=u+Pj+Gi+eij，其中Yij為性狀觀察值，u 為性狀總平均值，Pj為固定效應，Gi為基因型效應，eij為隨機誤差。

表1 PCR 擴增引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1KRT14基因編碼區(qū)SNPs 檢測及基因型頻率分析 3個引物經(jīng)過擴增、純化、送測后的測序結(jié)果與KRT14基因經(jīng)過序列比對后發(fā)現(xiàn)，僅在KRT14-2 片段獲得4 個SNPs，分別為位于第184、215、275、277 bp 處的T/C、T/C、A/C 和A/G 4 個突變位點，命名為g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A 和g.285 bp G＞A，均為同義突變。4 個SNPs 位點在江漢雞群體中的基因型頻率、等位基因頻率結(jié)果見表2，4 個SNPs 位點均存在3 種基因型，g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A和g.285 bp G＞A 這4 個位點的優(yōu)勢等位基因分別為C、C、A 和G，優(yōu)勢等位基因型分別為CT、CC、AA 和GG。

表2 蛋雞KRT14 基因基因型頻率和等位基因頻率

2.2KRT14基因SNPs 與雞蛋蛋品質(zhì)性狀的相關性分析 將檢測到的4 個突變位點不同基因型與雞蛋品質(zhì)性狀進行關聯(lián)分析，結(jié)果如表3 所示，KRT14基因突變位點g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A、g.285 bp G＞A，不同基因型與蛋重、蛋殼厚度、蛋殼強度等具有相關性（P＜0.05）。其 中g.184 bp C＞T 位點的CT 基因型、g.215 bp C＞T位點的CT 基因型、g.275 bp C＞A 位點的CC 基因型及g.285 bp G＞A 位點的GG 基因型具有更高的蛋殼強度和蛋殼厚度。

表3 蛋雞KRT14 基因4 個突變位點的多態(tài)性與雞蛋品質(zhì)性狀的關聯(lián)分析（平均值±標準差）

2.3 不同突變位點的單倍型組合鑒定

2.3.1 單倍型與單倍型組合的構建KRT14-2區(qū)域的4 個SNPs 突變位點，共形成了9 種單倍型，分別為CCAG、CCCG、CTAA、TCAG、TCAA、TCCG、TTAG、TTAA 和TTCG。利用PHASE 程序分析每個個體不同位點間的成對連鎖不平衡程度及單倍型block，結(jié)果如圖1 所示，根據(jù)4 個突變位點的連鎖不平衡分析，共找到1 個單倍型block，對該單倍型block 進行單倍型分析，在本實驗的江漢雞群體中發(fā)現(xiàn)9 種單倍型，分別命名為H1～H9。對H1～H9 組成的每個個體的單倍型組合進行分析，共發(fā)現(xiàn)23 種單倍型組合，見表4。

圖1 KRT14 基因單倍型域結(jié)構圖

表4 KRT14 基因單倍型組合

2.3.2 單倍型組合與蛋殼品質(zhì)性狀的關聯(lián)分析 在形成的23 種單倍型組合中，選擇數(shù)量最多的6 種優(yōu)勢單倍型組合與雞蛋蛋殼品質(zhì)性狀進行關聯(lián)分析，結(jié)果見表5。H1H9（其序列為CCAG/TTCG）單倍型組合個體的蛋殼強度、蛋殼厚度均高于其他單倍型組合個體（P＜0.05）。因此，在本實驗群體中H1H9（其序列為CCAG/TTCG）單倍型組合具有最佳的蛋殼品質(zhì)性狀。

表5 優(yōu)勢單倍型與蛋殼品質(zhì)性狀的關聯(lián)分析結(jié)果

3 討 論

雞蛋蛋殼強度和蛋殼厚度是影響雞蛋破損率和貨架期的重要因素，直接影響蛋雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。蛋殼質(zhì)量是影響雞蛋品質(zhì)的重要因素，因此解析影響雞蛋蛋殼品質(zhì)的形成及其調(diào)控機制是提高雞蛋蛋殼品質(zhì)的有效手段之一。已有研究表明，角蛋白（Keratin，KRT）基因主要表達于上皮細胞，是上皮細胞中最豐度的結(jié)構蛋白，也是表皮、毛囊、毛發(fā)和指甲的重要組成結(jié)構，為網(wǎng)狀結(jié)構，屬于角質(zhì)層的骨架蛋白[7-8]；其具有維持上皮細胞完整性、保護上皮細胞正常功能的運行[9]等作用，與細胞運動、增殖和細胞間的信息傳遞有關[10-11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)KRT14基因在宮頸組織的上皮細胞中高度表達，使上皮細胞過度增殖[12-13]；可能通過與蛋白激酶4（RIPK 4）相互作用從而調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞分化所需的角蛋白轉(zhuǎn)換[14]。KRT14和KRT5突變使異常角蛋白聚集于細胞核下及半橋粒，導致表皮基底細胞中間絲形成障礙，破壞了蛋白網(wǎng)絡的完整性和半橋粒的穩(wěn)定性，使角質(zhì)形成細胞受到外力時容易破裂，皮膚脆性增加[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，KRT14基因上的4 個SNPs 突變與蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋重、蛋黃重性狀顯著相關，且單倍型組合H1H9 個體的蛋殼強度、蛋殼厚度均顯著高于其他單倍型組合個體。綜上，推測KRT14基因可能與蛋殼強度和蛋殼厚度相關，KRT14基因可以作為影響雞蛋蛋殼品質(zhì)性狀的候選基因，而本研究獲得的4 個SNPs 突變位點可作為蛋殼品質(zhì)性狀分子標記輔助選擇的候選標記。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，在江漢雞KRT14基因編碼區(qū)內(nèi)共發(fā)現(xiàn)g.184 bp C＞T、g.215 bp C＞T、g.275 bp C＞A 和g.285 bp G＞A 4 個SNPs，均為同義突變；其中g.184 bp C＞位點的CT 基因型、g.215 bp C＞T 位點的CT 基因型、g.275 bp C＞A 位點的CC 基因型及g.285 bp G＞A 位點的GG 基因型具有更高的蛋殼強度和蛋殼厚度；單倍型組合H1H9（其序列為CCAG/TTCG）具有最佳的蛋殼品質(zhì)性狀。因此，KRT14基因編碼區(qū)的4 個SNPs 突變位點可作為蛋殼品質(zhì)性狀分子標記輔助選擇的候選標記。