趙弼時(shí)，劉建華，喬利英，劉旭瑩，王 鳳，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

脂肪組織在能量代謝中具有重要作用[1]。綿羊作為世界上主要的肉類家畜資源之一，過(guò)多的白色脂肪堆積會(huì)影響其胴體品質(zhì)[2]。同源框基因（Homeobox，HOX）家族編碼一類重要的發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子。綿羊HOX基因家族有39 個(gè)成員，分屬于HOXA、HOXB、HOXC和HOXD4 個(gè)基因集群[3]。該家族的許多成員參與脂肪形成[4-5]。HOXC8作為HOX家族的一員，在調(diào)控細(xì)胞成肌[6]、成骨[7]以及成脂分化等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)成脂分化的研究表明，HOXC8抑制人脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells，ADSCs）的分化和脂質(zhì)沉積[8]，且在不同的脂肪組織中差異表達(dá)[9-10]。可見(jiàn)，HOXC8在脂質(zhì)沉積中發(fā)揮著重要作用。

DNA 甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾方式。在3T3-L1 脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma，PPARγ）啟動(dòng)子區(qū)去甲基化，使其表達(dá)量升高，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[11]。人前體脂肪細(xì)胞中瘦素（Leptin，LEP）啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)時(shí)抑制其轉(zhuǎn)錄[12]，利于脂肪細(xì)胞的分化和脂滴沉積[13]。以上研究表明，脂肪分化相關(guān)基因可通過(guò)DNA 甲基化修飾來(lái)調(diào)控脂質(zhì)代謝。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)各存在1 個(gè)CpG 島，為研究HOXC8的DNA 甲基化在綿羊脂質(zhì)代謝中的作用提供了新的切入點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)闡明綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中HOXC8DNA甲基化程度及其轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)機(jī)制，為深入開(kāi)展綿羊脂肪代謝機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 將3 只15 日齡小尾寒羊屠宰后迅速去除皮毛，用無(wú)菌的剪刀、鑷子剪下0.5 cm × 0.5 cm 的皮下脂肪組織塊。用含有1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無(wú)菌PBS 溶液沖洗2～3 遍后，將組織塊浸泡于15 mL含有雙抗的PBS 溶液的離心管中，冷藏保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司；LB 固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶公司；基因組DNA 提取試劑、pMDTM19-T 載體、Trizol 試劑、各種工具酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa EpiTaqTMHS（for bisulfite-treated DNA）試劑盒和qPCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 試劑盒購(gòu)自凱杰生物技術(shù)有限公司；雙抗、胎牛血清和高糖DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自Biological Industries 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CpG 島預(yù)測(cè)分析 根據(jù)NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)上公布的綿羊HOXC8基因序列，利用MethPrimer 軟件（http://www.uro-gene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）預(yù)測(cè)綿羊HOXC8基因序列（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 和完整基因序列）的CpG 島位置，參數(shù)設(shè)置為Observed/Expected radio＞0.60，Percent C+Percent G＞50.00，Length＞200。

1.3.2 綿羊前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 按照參考文獻(xiàn)[14-16]中的方法，在嚴(yán)格無(wú)菌的環(huán)境下，使用II 型膠原酶從綿羊背部皮下脂肪組織中分離得到前體脂肪細(xì)胞。在37℃、5% CO2的條件下，用含1%雙抗和10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)綿羊前體脂肪細(xì)胞，每2 天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)綿羊前體脂肪細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液（在上述培養(yǎng)液中添加1 μmol/L 地塞米松，1 mg/L 胰島素，0.5 mmol/L IBMX）進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2 天換一次液，分別在分化第0、2、4、6、8、10、12 天收集細(xì)胞用于HOXC8時(shí)序表達(dá)的檢測(cè)和甲基化水平檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞總DNA 的提取 使用DNAiso Reagent 按照說(shuō)明書(shū)分別提取分化第0 天和第2 天的綿羊前體脂肪細(xì)胞中的基因組DNA。

1.3.4 細(xì)胞總RNA 的提取 使用RNAiso Plus 按照說(shuō)明書(shū)提取所收集細(xì)胞的總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品總RNA 濃度及OD260nm/OD280nm。

1.3.5 qPCR 根據(jù)NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中公布的綿羊HOXC8基因的mRNA 序列，以β-Actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)qPCR 引物，引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script?RT reagent kit with gDNA Eraser 的說(shuō)明書(shū)對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA 為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA 的表達(dá)量。反應(yīng)總體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA 產(chǎn)物2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；PCR 反應(yīng)階段95℃ 15 s、60℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析階段95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 HOXC8 和β-Actin mRNA 的qPCR 引物

1.3.6HOXC8CpG 島甲基化水平檢測(cè) 利用在線程序NEBuilder（http://nebuilder.neb.com/）軟件對(duì)HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)進(jìn)行甲基化引物設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表2。先利用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit 試劑盒對(duì)基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，然后利用TaKaRa EpiTaqTMHS （for bisulfite-treated DNA）試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，總體系為20 μL：TaKaRa EpiTaq HS 0.1 μL，EpiTaq PCR Buffer（10×）2 μL，25 mmol/LMgCl22.4 μL，dNTP Mixture 2.4 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 7.1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；PCR 擴(kuò)增94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；4℃保存。用2% 的瓊脂糖凝膠鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用膠回收純化試劑盒回收目的片段并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，將濃度高的純化產(chǎn)物與pMDTM19-T 載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化后涂板，培養(yǎng)12 h 后挑選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。將甲基化引物擴(kuò)增的序列和原始DNA 序列以及轉(zhuǎn)化序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)發(fā)生甲基化的CpG 島。

表2 HOXC8 甲基化水平檢測(cè)引物

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 甲基化水平差異的顯著性檢驗(yàn)通過(guò)SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件（Version 21.0，美國(guó)）分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用MSR（http://www.msrcall.com/MSRcalcalate.aspx）軟件分析BSP 測(cè)序結(jié)果，并用于甲基化圖譜的繪制和分析。熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法計(jì)算基 因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。使用GraphPad Prism7（GraphPad Software，美國(guó)）軟件中的一般線性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊HOXC8基因CpG 島預(yù)測(cè) 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HOXC8基因啟動(dòng)子區(qū)存在1 個(gè)CpG 島，位于HOXC8基因g.-397～-105 區(qū)域（圖1A），HOXC8完整基因序列中存在1 個(gè)CpG 島，位于HOXC8基因g.+98～+518 區(qū)域（圖1B），覆蓋其第1 外顯子區(qū)。

2.2 綿羊前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)效果與成脂能力 從綿羊皮下脂肪組織中分離出的前體脂肪細(xì)胞呈梭形，且細(xì)胞狀態(tài)良好（圖2A）。待綿羊前體脂肪細(xì)胞密度達(dá)到90% 左右，進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，10 d 后進(jìn)行油紅O 染色。分離出的前體脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生大量脂滴（圖2B）。結(jié)果表明從綿羊皮下脂肪組織中成功分離出前體脂肪細(xì)胞，可用于后續(xù)研究。

圖1 HOXC8 基因CpG 島預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 體外培養(yǎng)的綿羊前體脂肪細(xì)胞

2.3 綿羊HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)的BSP 結(jié)果對(duì)亞硫酸氫鹽處理后的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。HOXC8啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度約305 bp（圖3A）。HOXC8第1 外顯子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度約357 bp（圖3B），均為單一明亮條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。

圖3 BSP 處理后HOXC8 啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4HOXC8在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì) 如圖4 所示，HOXC8mRNA 的表達(dá)量在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化前極顯著高于分化后；分化第6 天HOXC8mRNA 的表達(dá)量顯著高于其他5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，但與分化前相比表達(dá)水平仍極低。結(jié)果說(shuō)明HOXC8可能主要在前體脂肪細(xì)胞分化前發(fā)揮作用。

2.5 綿羊HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)甲基化水平檢測(cè) 因?yàn)樵诰d羊前體脂肪細(xì)胞分化的第0 天和第2 天HOXC8的表達(dá)差異極顯著（圖4），故本研究選擇在分化的第0 天和第2 天檢測(cè)HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)的甲基化水平。

圖4 HOXC8 在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)

HOXC8基因啟動(dòng)子區(qū)包含38 個(gè)CG 位點(diǎn)，根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)繪制成甲基化圖譜（圖5）。結(jié)果顯示分化第0 天有8 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化，分化第2 天有6 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化。HOXC8第1 外顯子區(qū)包含32 個(gè)CG 位點(diǎn)，根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)繪制成甲基化圖譜（圖6）。結(jié)果顯示分化第0 天有10 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化，分化第2 天僅有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生甲基化。雖然都表現(xiàn)為較低的甲基化水平，但在分化第0 天甲基化水平顯著高于第2 天。由圖7 可見(jiàn)，HOXC8基因啟動(dòng)子區(qū)CG 位點(diǎn)的甲基化水平在分化第0 天和第2 天差異不顯著，說(shuō)明綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化不受HOXC8啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控；比較同一分化時(shí)期HOXC8啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)甲基化水平發(fā)現(xiàn)，第1 外顯子區(qū)甲基化水平都極顯著高于啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平（P＜0.001），說(shuō)明綿羊HOXC8第1 外顯子區(qū)甲基化水平調(diào)控前體脂肪細(xì)胞的分化。

2.6 綿羊HOXC8第1 外顯子區(qū)甲基化水平與其mRNA 表達(dá)豐度的線性回歸分析 由圖8 可知，HOXC8第1 外顯子區(qū)DNA 甲基化水平與表達(dá)水平呈高度正相關(guān)（r=0.994，P＜0.000 1），說(shuō)明在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中HOXC8第1 外顯子區(qū)甲基化水平正調(diào)控其mRNA 的表達(dá)。

3 討 論

圖5 HOXC8 啟動(dòng)子區(qū)的DNA 甲基化圖譜

圖6 HOXC8 第1 外顯子區(qū)的DNA 甲基化圖譜

油紅O 可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂滴進(jìn)行著色，清楚地顯示脂肪細(xì)胞形態(tài)和脂滴分布，便于分析細(xì)胞內(nèi)甘油三酯沉積情況。豬背最長(zhǎng)肌來(lái)源的肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞在分化第8 天時(shí)用油紅O 染色形成大量脂滴[17]。本研究采用膠原酶法分離獲得的綿羊前體脂肪細(xì)胞呈梭形，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量脂滴。

圖7 HOXC8 啟動(dòng)子區(qū)和第1 外顯子區(qū)的甲基化水平

圖8 HOXC8 第1 外顯子區(qū)甲基化水平和mRNA表達(dá)水平回歸分析

HOXC10在綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中mRNA 的表達(dá)量隨著時(shí)間的推移逐漸下降[18]。在誘導(dǎo)ADSCs 成脂分化過(guò)程中，HOXC8的表達(dá)量在脂肪形成過(guò)程中呈下降趨勢(shì)[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HOXC8mRNA 表達(dá)量在前體脂肪細(xì)胞分化前顯著高于分化后，說(shuō)明HOXC8可能主要在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化前發(fā)揮生物學(xué)功能。

本研究中綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中HOXC8mRNA 的表達(dá)不受其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控。在豬前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（Thioredoxin-Interacting Protein，TXNIP）啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平基本為0，且不隨表達(dá)量的升高而變化，說(shuō)明TXNIP的表達(dá)可能不受其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控[19]，與本研究結(jié)果一致。小鼠脂肪細(xì)胞分化前HOXA5啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著低于誘導(dǎo)分化第4 天，且與其表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[20]，與本研究中前體脂肪分化不受HOXC8啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控相矛盾，這可能與物種或選擇分化時(shí)間的不同有關(guān)。關(guān)于在綿羊前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化2 d后HOXC8啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平有待于進(jìn)一步研究。

許多研究證實(shí)，DNA 甲基化可以抑制或沉默基因的表達(dá)[21-22]。但也有報(bào)道顯示在基因不同位置的DNA甲基化可以對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生相反的作用。在脊椎動(dòng)物中，當(dāng)甲基化位于基因編碼區(qū)時(shí)，不僅沒(méi)有抑制基因的表達(dá)，相反還起到促進(jìn)作用[23]。人類全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示，基因編碼區(qū)的DNA 甲基化與基因表達(dá)呈正相關(guān)[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，HOXC8第1 外顯子區(qū)甲基化水平正調(diào)控HOXC8mRNA 的轉(zhuǎn)錄。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，HOXC8可能主要在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化前發(fā)揮作用，在分化過(guò)程中HOXC8在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)受第1 外顯子區(qū)甲基化的正調(diào)控。