賀名揚(yáng) ，劉愛菊，張 鑫，周榮艷，田樹軍，白 瑩*，陳曉勇*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056000）

寒泊羊是以杜泊綿羊?yàn)楦副?、小尾寒羊?yàn)槟副窘?jīng)過十余年培育的肉繁兼用新種群，于2014 年通過河北省畜牧獸醫(yī)局組織的中試論證，該種群繁殖性能明顯[1]，但肉用性能選育仍停留在增重等表型層面。因此，篩選、挖掘、鑒定影響肌肉組織發(fā)育的關(guān)鍵候選基因有助于解析肌肉組織發(fā)育規(guī)律，為肉質(zhì)性狀遺傳機(jī)理研究和選育提供理論依據(jù)。RNA-seq 技術(shù)可從轉(zhuǎn)錄水平篩選差異表達(dá)的基因，已廣泛應(yīng)用于畜禽動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)性狀遺傳機(jī)理研究[2-4]。

核糖體蛋白基因（RPL35A）位于人3 號(hào)染色體的q29-qter 區(qū)段，編碼大亞基中的核糖體蛋白L35AE 家族中的RPL35A 蛋白。在小鼠中，該蛋白位于核糖體中的P 位和A 位或完全位于P 位，與啟動(dòng)因子及延伸因子相結(jié)合參與核糖體的翻譯活動(dòng)[5-6]。杜玉杰等[7]對(duì)大熊貓RPL35A基因及其編碼的蛋白序列研究發(fā)現(xiàn)，RPL35A其理化性質(zhì)和功能位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中高度保守，對(duì)于核糖體編碼蛋白質(zhì)極其重要。此外，有研究表明RPL35A基因變異與再生障礙性貧血有關(guān)[8-11]。Pappas 等[12]研究發(fā)現(xiàn)60S 核糖體亞單位的L35a 和40S 核糖體亞單位的S5 表達(dá)受分化鼠類紅白血病細(xì)胞的共同機(jī)制調(diào)節(jié)，導(dǎo)致核糖體功能下降。目前，RPL35A基因在畜禽領(lǐng)域的研究報(bào)道很少。本團(tuán)隊(duì)前期研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法篩選到RPL35A基因?yàn)椴煌慢g寒泊羊mRNA 差異表達(dá)基因（未發(fā)表），為此，本研究利用定量PCR 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的RPL35A基因表達(dá)，并利用生物信息學(xué)分析RPL35A基因的核苷酸及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其特性，為探究寒泊羊RPL35A基因與綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 隨機(jī)選取無(wú)親緣關(guān)系的1 月齡、7 月齡、13 月齡寒泊公羊各3 只。采集背最長(zhǎng)肌3～5 g，用無(wú)菌生理鹽水沖洗，放入2 mL 冷凍管，迅速置于液氮中暫時(shí)保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后在-80℃冰箱中保存。

1.2 主要試劑與儀器 動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker 和熒光定量試劑盒均購(gòu)自全式金（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司。實(shí)時(shí)PCR 儀為ABI 7300（Applied Biosystems,Foster City,CA,U.S.A.）。

1.3 引物合成 從GenBank 中下載綿羊RPL35A基因的mRNA 序列（XM_004002995.3），使用Primer 5 設(shè)計(jì)特異引物。引物：RPL35AF：5'-TACAAAGCAAAG AACAACA-3'，RPL35AR：5'-GGTACAGCATCACAC GAAT-3'，產(chǎn)物片段為169 bp，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） 基因作 為內(nèi)參。GAPDHF：5'-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3'，GAPDHR：5'-CA GTGGTCATAAGTCCCTCC-3'，產(chǎn)物片段為107 bp。

1.4 組織RNA 提取及cDNA 合成 取100 mg 樣品在液氮中迅速研磨成粉末，依據(jù)Trizol 法提取各組織總RNA，測(cè)定濃度和純度，取10 μLRNA 樣品，70℃處理2 min，2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度。按照大連寶生物的PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 將合格的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)豐度 以背最長(zhǎng)肌cDNA 為模板，利用RPL35A F1/R1 特異引物擴(kuò)增RPL35A基因的編碼區(qū)序列，反應(yīng)體系（20 μL）：熒光染 料Mix 8 μL，ROX 3 μL，模 板1 μL （50 ng/μL），上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，Taq 酶0.2 μL，無(wú)酶水7 μL。三步法反應(yīng)程序：98℃ 3 min；98℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95° C 10 s，60° C 30 s 和72° C 30 s，40個(gè)循環(huán)。模板的擴(kuò)增階段，60～95℃，每15 s 緩慢升溫0.3℃，建立熔解曲線階段。按照熒光定量試劑盒說明書操作，將GADPH基因?yàn)閮?nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 RNA-seq 結(jié)果由FPKM 法計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)所采用的熒光定量法為相對(duì)熒光定量，按照2-△△Ct相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算，二者之間計(jì)算方式不同。因此在進(jìn)行比對(duì)時(shí)需將數(shù)據(jù)均一化處理，對(duì)分析得到的數(shù)據(jù)再使用SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 序列獲取及進(jìn)化樹構(gòu)建 通過NCBI 網(wǎng)站中Blastp 應(yīng)用程序下載13 個(gè)物種的RPL35A 氨基酸序列及其核苷酸序列，使用DNAStar Lasergene 應(yīng)用程序MegAlign 軟件對(duì)綿羊及獲取的12 個(gè)物種RPL35A基因的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析綿羊RPL35A 與其他物種的相似性。使用MEGA 7.0 軟件基于近鄰結(jié)合（Neighbor-Joining，NJ）法（number of Bootstrap replication :1000）對(duì)綿羊及其他13 個(gè)物種RPL35A 氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7.2 理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用ExPASy數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中的ProtParam 工具（http://web.expasy.org/protparam/），分析RPL35A 的分子式、分子質(zhì)量、酸堿性、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。使用ProtScale工具（https://web.expasy.org/protscale/）分析RPL35A的親疏水性。利用SignalP 4.1 Severve 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/） 分 析RPL35A有無(wú)信號(hào)肽，使用TMHMM Server v.2.0 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 分 析RPL35A 有無(wú)跨膜區(qū)域。利用在線工具NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析RPL35A 的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。使用PSORT II 軟件（www.genscript.com/psort.）預(yù) 測(cè)RPL35A 的亞細(xì)胞定位。

1.7.3 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用 Conserved Domains 在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)綿羊RPL35A 蛋白的結(jié)構(gòu)域。使用SOPMA 在線預(yù)測(cè)軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)山羊RPL35A 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL 在線軟件（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7.4 預(yù)測(cè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），將可信度值設(shè)置為0.7，控制互作蛋白的數(shù)量在10 以內(nèi)，構(gòu)建RPL35A 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同月齡背最長(zhǎng)肌mRNA 表達(dá)豐度比較 由圖1 可知，1 月齡寒泊羊背最長(zhǎng)肌RPL35A基因mRNA 高于7月齡，后者低于13 月齡，表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠，該基因可能與寒泊羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

圖1 RPL35A 基因在不同月齡綿羊肌肉中的表達(dá)

2.2 不同物種RPL35A 序列系統(tǒng)發(fā)育分析以及相似性比較 由表1 可知，綿羊RPL35A基因核苷酸及氨基酸序列與山羊、牛、豬、家馬、貓的相似性較高。對(duì)綿羊及其他13 個(gè)物種RPL35A 氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿羊與山羊、牛、豬同源性最高，聚為一支。與靈長(zhǎng)目的人、黑猩猩、大猩猩同源性居中，與嚙齒目的鼠及魚類的斑馬魚同源性較低（圖2）。

表1 綿羊RPL35A 基因與其他物種氨基酸和核苷酸序列相似性分析

圖2 RPL35A 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析NJ 樹

2.3 RPL35A 蛋白特性分析 ExPASy 在線軟件發(fā)現(xiàn)該蛋白分子質(zhì)量為125.51 ku，分子式為C561H907N175O145S4，理論等電點(diǎn)PI=11.07，為堿性蛋白質(zhì)。RPL35A 為親水蛋白（圖3-A），親水性總平均值（GRAVY）為-0.579。哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞半衰期為30 h，且不穩(wěn)定性系數(shù)是35.85，證明其屬于穩(wěn)定蛋白。RPL35A 蛋白親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)位于19 位的精氨酸，值為-2.722，29 位的賴氨酸為疏水性最強(qiáng)位點(diǎn)，值為1.067，疏水區(qū)域少于親水區(qū)域，進(jìn)一步印證了親水性分析結(jié)果。信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析可知，綿羊RPL35A 蛋白序列中不包含信號(hào)肽（圖3-B）。RPL35A 蛋白為親水性蛋白。通過TMHMM Server v.2.0 在線分析發(fā)現(xiàn)。該蛋白未見到跨膜信號(hào)，因此不屬于跨膜蛋白（圖4）。

圖3 RPL35A 蛋白特性分析

圖4 RPL35A 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)RPL35A 蛋白包含了多個(gè)可能存在的位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）略低于酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）含量（圖5）。預(yù)測(cè)得分（Score）介于0.000～1.000，分值超過0.500 表示有被磷酸化的可能。

圖5 RPL35A 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.4 預(yù)測(cè)RPL35A 蛋白亞細(xì)胞的定位 亞細(xì)胞定位可明確蛋白質(zhì)或表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，經(jīng)PSORT II 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析可知，RPL35A 蛋白在線粒體（69.6%）、細(xì)胞核（17.4%）、細(xì)胞質(zhì)（8.7%）、過氧化物酶體（4.3%）內(nèi)發(fā)揮作用。

2.5 RPL35A 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)綿羊RPL35A 蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明綿羊RPL35A 蛋白屬于RPL35Ae超家族成員，有1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。

2.6 RPL35A 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA 在線分析軟件，對(duì)綿羊RPL35A 蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白中有1.26%的α-螺旋、26.36%的延伸鏈、5.44%的β-轉(zhuǎn)角、66.95%的無(wú)規(guī)則卷曲，構(gòu)成上述結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基數(shù)目分別為3、63、13、160 個(gè)，說明RPL35A 蛋白結(jié)構(gòu)元件主要為無(wú)規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈也占一定比例，α-螺旋較少。在SWISS-MODEL網(wǎng)頁(yè)中提交綿羊RPL35A 氨基酸序列后預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖6 所示，綿羊RPL35A 蛋白序列與Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中的模板序列相似性高達(dá)82.22%，同時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GMQE 為0.57，QMEAN 為-1.90，覆蓋率為82.22%，表明該結(jié)構(gòu)模型合理。

圖6 RPL35A 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 RPL35A 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 由圖7 可知，RPL35A與核糖體蛋白合成具有緊密的蛋白互作聯(lián)系，網(wǎng)絡(luò)中的RPL11、RPL18A、RPL29 及RPS3、RPS11、RPS17、RPS19 和RPS20 蛋白彼此之間具有緊密的關(guān)聯(lián)性，表明RPL35A 與多個(gè)核糖體蛋白互作在核糖體合成中發(fā)揮重要作用。

圖7 綿羊RPL35A 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

3 討 論

RPL35基因是60S 核糖體亞基的重要組成成分，在蛋白質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮重要作用[13]。寒泊羊出生后，RPL35A基因的表達(dá)豐度隨著月齡增加以及自身生長(zhǎng)發(fā)育的改變而改變。1 月齡為羔羊肌纖維發(fā)育的初級(jí)階段，6～7 月齡為商品肉羊育肥出欄階段，12～13 月齡是骨骼肌發(fā)育基本成熟的階段，因此本實(shí)驗(yàn)選取這3 個(gè)發(fā)育階段。本研究結(jié)果顯示，RPL35A基因在1 月齡寒泊羊背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量達(dá)到最高，7 月齡達(dá)到最低，表達(dá)量曲線呈“U”型，熒光定量結(jié)果與RNA-seq 結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致，說明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠，RPL35A基因與寒泊羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，綿羊RPL35A基因所編碼的蛋白分子式為C561H907N175O145S4，分子質(zhì)量為125.51 ku，該基因的蛋白質(zhì)和核酸序列與豬[14]、牛[15]相似性高?？缒ば盘?hào)分析和信號(hào)肽分析結(jié)果表明該蛋白不屬于跨膜蛋白且不包含信號(hào)肽；多肽序列分析發(fā)現(xiàn)有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，且主要分布在N-端的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此外，發(fā)現(xiàn)該序列主要在線粒體和細(xì)胞核中發(fā)揮作用。該蛋白分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)與大熊貓RPL35A蛋白分子量為12.5355、pI 為11.63 接近[7]，可見該蛋白非常保守。RPL35A 蛋白屬于RPL35Ae 超家族成員，有1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是不規(guī)則卷曲，還存在一定比例的延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角以及少量的α-螺旋，其三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板序列相似性高達(dá)99.09%。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法篩選到了RPL35A基因?yàn)楹囱蛏L(zhǎng)發(fā)育mRNA 差異表達(dá)基因，為綿羊的肌肉組織發(fā)育提供參考和研究?jī)r(jià)值。目前，有關(guān)RPL35A基因的生理功能認(rèn)識(shí)還非常有限，除了與人貧血癥有關(guān)外[16]，研究表明真核生物翻譯延長(zhǎng)因子2（eEF2）是RPL35A基因下調(diào)的信號(hào)分子，牛乳腺上皮細(xì)胞RPL35A基因與eEF2 作用調(diào)節(jié)β-酪蛋白合成，RPL35A基因是蛋氨酸調(diào)控β-酪蛋白翻譯延長(zhǎng)和分泌的重要正調(diào)控因子[13]。此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA lncNB1 通過與核糖體蛋白R(shí)PL35 相互作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生[17]。RPL35 基因是如何在核糖體中調(diào)控目標(biāo)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)以及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用機(jī)制有待深入研究。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)不同月齡背最長(zhǎng)肌組織中RPL35A基因mRNA 差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)慈庋蚣∪馍L(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。綿羊RPL35A基因序列分析發(fā)現(xiàn)其與山羊、牛、豬的RPL35A基因核苷酸及氨基酸序列同源性較高，屬于親水性穩(wěn)定蛋白，含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主。與RPL11、RPL29、RPL18A 及RPS3、RPS11、RPS17、RPS19 和RPS20 蛋白互作，從而進(jìn)一步調(diào)控不同發(fā)育階段寒泊肉羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。