(AME出版社)

圖1 李大力教授

李大力教授，PhD，華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員，博士生導(dǎo)師，基金委杰出青年基金獲得者。2007年獲湖南師范大學(xué)遺傳學(xué)博士學(xué)位，畢業(yè)后在華東師范大學(xué)工作至今?，F(xiàn)為華東師范大學(xué)生命醫(yī)學(xué)系主任主任，上海市調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任。

多年來通過優(yōu)化創(chuàng)新基因編輯技術(shù)，圍繞罕見病的模型構(gòu)建和基因治療，開展了深入研究。開發(fā)了精度和活性更高的新型胞嘧啶堿基編輯器(命名為：hyCBE)和新型雙功能堿基編輯器(命名為：A&C-BEmax)等多種堿基編輯系統(tǒng)，以血友病和β地中海貧血等單基因遺傳病為模型，建立了基于基因編輯技術(shù)的遺傳病基因治療新策略。迄今，共發(fā)表SCI論文90余篇，作為通訊作者在Nature Biotechnology，Nature Cell Biology，PNAS和Cell Research等高水平期刊發(fā)表論文30多篇。

圖2 李教授在眼科中心進(jìn)行學(xué)術(shù)分享

圖3 李教授在眼科中心進(jìn)行學(xué)術(shù)分享

圖4 李教授在眼科中心進(jìn)行學(xué)術(shù)分享

《眼科學(xué)報(bào)》：作為基因編輯領(lǐng)域研究的先鋒之一，您能跟我們分享一下目前血友病(hemophilia)和β型地中海貧血(thalassemias)等單基因疾病基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展嗎？

李大力教授：基因編輯治療β型地中海貧血的技術(shù)，在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的進(jìn)展都非?？?。2020年12月在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(New England Journal of Medicine)發(fā)表了CRISPR Therapeutics公司通過CRISPR基因編輯技術(shù)，用靶向BCL11A基因的紅系增強(qiáng)子，重新激活胎兒血紅蛋白生成的策略，分別在一個(gè)β型地中海貧血和鐮刀型貧血(sickle-cell disease，SCD)成年患者中進(jìn)行了經(jīng)基因編輯的自體造血干細(xì)胞移植治療的文章。文中提到，在為期一年半左右的跟蹤研究中，患者完全擺脫了輸血依賴，獲得了非常好的治療效果。而在2020年底的美國(guó)血液學(xué)會(huì)(American Society of Hematology，ASH)上，該公司報(bào)道了10位患者的數(shù)據(jù)，在接受治療后，所有患者的血紅蛋白總水平都“正常或接近正?！?。由于在臨床上的出色表現(xiàn)，CRISPR技術(shù)治療遺傳性貧血癥的工作也被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為2020年十大科學(xué)突破。眾所周知，CRISPR Therapeutics的聯(lián)合創(chuàng)始人之一、CRISPR技術(shù)的主要發(fā)明名人埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)，與詹妮弗·杜德納(Jennifer Doudna)共同獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

2020年，我們?nèi)A東師范大學(xué)團(tuán)隊(duì)與湘雅醫(yī)學(xué)院合作，采用CRISPR技術(shù)編輯患者自體造血干細(xì)胞，開展了“經(jīng)γ珠蛋白重激活的自體造血干細(xì)胞移植治療重型β型地中海貧血安全性及有效性”的臨床研究。兩位受試者分別為7歲和8歲的兒童，均為輸血依賴的重型β型地中海貧血患者，通常2～3周需要接受一次輸血。他們?cè)诮邮苤委煹侥壳盀橹辜s9個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，只在造血干細(xì)胞移植后的1個(gè)月內(nèi)接受了一次輸血。目前血紅蛋白水平已經(jīng)完全恢復(fù)正常，擺脫了輸血依賴，取得了非常顯著的治療效果。值得一提的是，其中1例是β0/β0型重度地貧患者，是全球第一例用CRISPR技術(shù)治療的最嚴(yán)重基因突變型的地中海貧血患者。

血友病方面，我們課題組也是最早使用CRISPR-Cas9基因編輯的方法來開展B型血友病臨床前研究的團(tuán)隊(duì)。我們?cè)?016年發(fā)表的一篇論文中報(bào)道了通過Cas9激活的位點(diǎn)特異性同源重組，修復(fù)凝血因子九(F9)基因中的致病堿基突變，在小鼠模型中觀察到了長(zhǎng)久的療效。

相比于傳統(tǒng)的基因替代療法存在的持久性問題，基因編輯理論上有可能一次治療終身獲益。其實(shí)早在2015年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已經(jīng)批準(zhǔn)了桑加莫生物制藥公司(Sangamo Therapeutics,Inc.)利用鋅指核酸酶(ZFN)定點(diǎn)整合凝血因子九基因來治療B型血友病的臨床研究。雖然該療法在2016被FDA授予孤兒藥資格，但是還沒有臨床數(shù)據(jù)公布。

從我個(gè)人的角度來看，在動(dòng)物模型中通過基因編輯在肝細(xì)胞中定點(diǎn)整合凝血因子基因有不錯(cuò)的效果，但是要應(yīng)用到臨床還有一定的難度，主要還是同源重組的效率不夠高，而患者中的基因?qū)胄室彩且粋€(gè)大的問題。不過從整個(gè)基因治療的應(yīng)用來說，血友病是相對(duì)容易突破的疾病，它對(duì)于基因編輯的效率要求沒那么高。我們之前的工作就證明，動(dòng)物體內(nèi)只要0.5%～1%的修復(fù)率就能達(dá)到好的療效。

當(dāng)然，基因編輯治療血友病，更多的還是通過腺相關(guān)病毒載體(Adeno-Associated Virus，AAV)過表達(dá)的基因替代療法，最近國(guó)際上也有很多進(jìn)展。有的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在跟蹤了2～3年之后，B型血友病患者的凝血因子活性仍然很高，把出血事件概率降低了95%以上。而A型血友病的基因治療就相對(duì)困難，因?yàn)槟蜃影?F8)基因片段非常大，無(wú)法包裝進(jìn)AAV載體，即便通過序列優(yōu)化，B-domain缺失的F8也已經(jīng)達(dá)到AAV包裝上限。所以受限于病毒包裝等問題，A型血友病的基因替代療法雖然在臨床上也看到了顯著的療效，但是受試者在隨訪的3年內(nèi)，凝血因子活性呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，其長(zhǎng)期療效看上去不是很樂觀。

《眼科學(xué)報(bào)》：您和您的團(tuán)隊(duì)開發(fā)了精度和活性更高的hyCBE和A&C-BEmax等多種單堿基編輯系統(tǒng)，您能跟我們分享一下在開發(fā)過程中的遇到的一些困難以及您和您的團(tuán)隊(duì)是如何解決的嗎？

李大力教授：在hyCBE和A&C-BEmax開發(fā)的實(shí)際工作中，并沒有碰到太多技術(shù)上的困難，我們更多的壓力是來自于國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)。因?yàn)榛蚓庉嫾夹g(shù)應(yīng)用前景十分廣闊，各個(gè)國(guó)家都非常重視。而基因編輯最大的難度在于研發(fā)性能提升的原創(chuàng)工具，可以說是“兵家必爭(zhēng)之地”。

開發(fā)基因編輯工具，我們能想到，其他國(guó)際上的同行未必就想不到。怎么樣在最短的時(shí)間內(nèi)，通過最大量、最真實(shí)的數(shù)據(jù)，最快速地完成基因編輯工具的性能鑒定，做出最終成果并發(fā)表出來，才是我們需要解決的最大問題。

我們后續(xù)可以看到，在A&C-BEmax這個(gè)雙堿基編輯器的研發(fā)方面，與我們同期在《自然-生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志發(fā)表的還有另外三個(gè)課題組的類似工作，所以競(jìng)爭(zhēng)非常激烈。在研發(fā)過程中，我們可以說投入了百分之百的精力，最終憑借團(tuán)隊(duì)在基因編輯領(lǐng)域研究的多年經(jīng)驗(yàn)和成熟的技術(shù)體系，保障了以理論上最短的時(shí)間內(nèi)完成了這些工作。

《眼科學(xué)報(bào)》：動(dòng)物模型作為基礎(chǔ)研究的一種很重要的研究手段，在您看來它的構(gòu)建還有哪些可以進(jìn)一步優(yōu)化的地方？

李大力教授：目前動(dòng)物模型的構(gòu)建技術(shù)，還是能較好地滿足現(xiàn)有的基因編輯研究需求。比方說，用CRISPR-Cas9在動(dòng)物胚胎中做基因敲除，或者是引入點(diǎn)突變來制備動(dòng)物模型，在成熟的實(shí)驗(yàn)室是一個(gè)常規(guī)的技術(shù)，基本上可以一次性成功。

但是要進(jìn)行大片段DNA的替換、整合或者整合超過3kb的外源基因片段，效率就比較低了。如果未來基因編輯底層工具能有更多的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)高效精確的大片段DNA整合，那將更好地提高復(fù)雜基因修飾動(dòng)物模型構(gòu)建的效率。

《眼科學(xué)報(bào)》：我們都知道從事基因編輯基礎(chǔ)研究的最終目的是應(yīng)用到臨床治療具體的疾病，但是從動(dòng)物模型過渡到臨床應(yīng)用需要大量的驗(yàn)證，并且存在倫理問題，2018年深圳的“基因編輯嬰兒”事件就因?yàn)閭惱韱栴}引發(fā)了巨大的爭(zhēng)議。目前是否有一些疾病已經(jīng)被批準(zhǔn)可以通過基因編輯來治療了呢？

李大力教授：2018年的“基因編輯嬰兒”事件，我最初看到的時(shí)候以為是炒作之類的不實(shí)信息，后面核實(shí)之后，感到非常意外。因?yàn)閷?duì)于生命醫(yī)學(xué)研究人員來說，大家都很清楚倫理的底線在哪里。國(guó)際國(guó)內(nèi)也有明文的規(guī)定不能將人類胚胎體外培養(yǎng)超過14天，更加不能將基因操作過的人類胚胎植入人或任何其它動(dòng)物的生殖系統(tǒng)。這是不可觸碰的紅線。雖然目前人類基因的基礎(chǔ)研究進(jìn)行了很多年，但是我們對(duì)每一個(gè)基因的具體功能是不清楚的，對(duì)于基因編輯工具的具體性能也是不完全了解的，即便用最先進(jìn)的方法來檢測(cè)基因編輯是否脫靶，也不能百分之百保證基因操作不會(huì)有其他的問題。如果人為地改變?nèi)祟惿臣?xì)胞或者胚胎的基因組，導(dǎo)致遺傳基因的改變，對(duì)整個(gè)人類而言是非常危險(xiǎn)的。

并且這個(gè)事件從基因治療的概念上來說也行不通。因?yàn)榘滩』颊呱『⒖梢酝ㄟ^輔助生殖等多種手段阻斷病毒傳播。雖然趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)是HIV的共同受體之一，但在胚胎中將其敲除在理論上也是不可取的。因?yàn)镃CR5這個(gè)基因在人體的其他正常功能尚不明確，敲除之后對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生多大的影響，目前都是未知的。所以，人類生殖細(xì)胞或者胚胎的基因編輯是非常需要注意的，而可遺傳的人類基因改造是生物與醫(yī)學(xué)研究人員不能觸碰并且要共同守住的倫理道德底線。

在HIV治療方面，2019年，陳虎、鄧宏魁和吳昊團(tuán)隊(duì)在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究，通過CRISPR技術(shù)敲除健康供者造血干細(xì)胞中的CCR5基因，為一名患有HIV-AIDS和急性淋巴細(xì)胞白血病(T細(xì)胞型)的患者進(jìn)行了骨髓移植。證明了經(jīng)基因編輯后的成體造血干細(xì)能在人體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定的造血系統(tǒng)重建，這個(gè)治療手段不會(huì)造成可遺傳的基因改變，我覺得是一個(gè)非常理性的方法。

基因編輯CRISPR-Cas9技術(shù)從發(fā)明到應(yīng)用也才幾年時(shí)間，發(fā)明時(shí)間較長(zhǎng)的鋅指核酸酶技術(shù)目前還達(dá)不到CRISPR-Cas9的效率。雖然也有團(tuán)隊(duì)開展鋅指核酸酶技術(shù)的臨床研究，但是沒有看到特別突出的成果。目前為止，僅有幾個(gè)疾病的基因編輯治療研究被FDA批準(zhǔn)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，其中包括β型地中海貧血和先天性黑矇癥等。所以現(xiàn)在基因編輯治療疾病仍處在臨床前或者臨床研究階段，還沒有真正獲批的基因治療藥物。

《眼科學(xué)報(bào)》：在您目前主持的課題中，有關(guān)于先天性或者遺傳性視神經(jīng)萎縮的研究，未來視神經(jīng)萎縮會(huì)成為您的主要研究方向嗎？

李大力教授：目前我們?cè)谶@方面的研究還不是很成熟，因?yàn)樵谝暽窠?jīng)里導(dǎo)入基因有很大的難度。我們嘗試過腺相關(guān)病毒載體玻璃體腔注射等手段，感染效率都比較低，對(duì)視神經(jīng)萎縮的治療研究還是很有挑戰(zhàn)。

不過通過這個(gè)課題，我們建立了一些遺傳性視神經(jīng)萎縮的動(dòng)物模型，也在開展進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和表型分析。如果未來進(jìn)行眼睛相關(guān)的研究，我們更多會(huì)考慮靶向視網(wǎng)膜色素細(xì)胞或者通過視網(wǎng)膜下腔注射導(dǎo)入基因的方式來進(jìn)行治療的研究工作。

《眼科學(xué)報(bào)》：從您多年的科研實(shí)踐出發(fā)，您覺得我國(guó)的基因編輯技術(shù)目前在國(guó)際上處于一個(gè)什么樣的水平？

李教授：我們國(guó)家的基因編輯技術(shù)，在國(guó)際上處于比較領(lǐng)先的水平。我國(guó)在基因編輯領(lǐng)域有一定的投入，加上國(guó)內(nèi)研究人員的興趣濃厚，在文章發(fā)表和專利申請(qǐng)數(shù)量上，中國(guó)僅次于美國(guó)。從基礎(chǔ)研究或者基因編輯工具的開發(fā)來看，雖然我們沒有開發(fā)很多完全意義上的概念性創(chuàng)新的基因編輯工具，但是我們?cè)趬A基編輯、新的CRISPRCas9工具的發(fā)現(xiàn)和鑒定方面，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。

最近幾年，隨著國(guó)內(nèi)的細(xì)胞治療、基因治療的商業(yè)化程度越來越高，從基礎(chǔ)到臨床的研究，我們跟美國(guó)差不多是同步的，實(shí)踐上的差距已經(jīng)非常小了。從應(yīng)用的角度，特別是基因編輯在植物上應(yīng)用，眾所周知，我們國(guó)家處于一個(gè)比較領(lǐng)先的地位。

當(dāng)然，希望未來我們能發(fā)明更多概念性創(chuàng)新的基因編輯工具，解決大片段高效精準(zhǔn)整合的難題，這樣可以進(jìn)一步拓展基因編輯技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景。