楊光耀，田平雅，呂苗苗，牛 春

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏 銀川 750000）

泰樂菌素（tylosin,Tyl）是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素，其抗菌譜廣，在應(yīng)對G+菌感染以及畜牧增產(chǎn)方面有巨大作用，應(yīng)用于獸藥及飼料添加劑。目前，在工業(yè)生產(chǎn)中，弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradie）是泰樂菌素的主要生產(chǎn)菌[1-3]，泰樂菌素對G+菌及某些G-菌（如金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎雙球菌等）有效，對螺旋體與支原體有特效。它不僅對雞的敗血癥、豬的流行性肺炎和赤病及小牛支原體引起的肺炎有很好的療效，而且對畜、禽的生長有明顯的促進作用，被廣泛地用于畜禽生產(chǎn)及獸醫(yī)治療，市場需求量極大[4,5]。

發(fā)酵過程中影響泰樂菌素效價的因素眾多，主要包括原料的碳氮比和培養(yǎng)基的pH 等。原料碳氮比對發(fā)酵過程中產(chǎn)物的積累有非常大的影響，李鑫[6]等人發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)物積累階段，較高的碳氮比可有效地抑制副產(chǎn)物的形成而促進目標產(chǎn)物的積累，利于目標產(chǎn)物效價的提高。發(fā)酵液的 pH 值是微生物代謝的綜合效果，對菌體的生長和產(chǎn)物的合成具有很大影響，當碳源不足時，有機氮源作為碳源利用，則 pH 會上升，氮代謝過程中氨基酸中的-NH2被利用后 pH 會下降。因此，可以嘗試通過控制發(fā)酵液中碳源和氮源的含量間接控制發(fā)酵液的 pH，從而提高泰樂菌素的效價。本文主要通過控制泰樂菌素發(fā)酵過程中發(fā)酵液的碳氮比，研究發(fā)酵過程中碳氮比對 pH 和泰樂菌素效價的影響，為泰樂菌素發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株 弗氏鏈霉菌，保藏自寧夏泰瑞制藥股份有限公司。

1.1.2 實驗培養(yǎng)基 實驗中所用培養(yǎng)基類型及配方見表1。

1.1.3 主要實驗儀器 實驗中所用的主要儀器見表2。

表1 實驗培養(yǎng)基配方

表2 試驗主要儀器清單

1.2 實驗方法

1.2.1 泰樂菌素的發(fā)酵過程斜面培養(yǎng)：用接種鏟刮取兩鏟孢子接種于 5ml 無菌水（加入 玻璃珠）于 37℃，150 r/min 培養(yǎng) 30 min。過濾，收集濾液。9 000 轉(zhuǎn)/min 離心 5 min，棄去大部分上清液，用剩余的液體（1 ml 左右）懸浮菌體，制成孢子懸浮液，涂布于試管斜面，32℃培養(yǎng) 8～12 d。搖瓶種子液的制備：在凈化工作臺上鏟取斜面4～8 cm2接種于 750 ml 三角搖瓶中，于溫度 28～30℃、濕度30%～50%、搖床轉(zhuǎn)速 200～250 r/min 的條件下培養(yǎng) 40～48 h。

一級種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的搖瓶種子液用火焰接種法接種于一級種子罐，接種量200 ml。工藝控制參數(shù)：罐溫30.0±0.2℃，罐壓0.06±0.002 MPa，空氣流量0.20～0.70 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速150～450 r/min，DO≥45%。

二級種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的一級種子液用壓差法移種于二級種子罐，移種量10%。工藝控制參數(shù)：罐溫29.0±0.2℃，罐壓0.06±0.002MPa，空氣流量0.5～1.5 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速 200～600 r/min，DO≥45%。

發(fā)酵培養(yǎng)：以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持碳源（玉米粉）含量不變，氮源（黃豆餅粉）含量分別按照0.5%、5%、10%、15%、20%配制培養(yǎng)基，其他成分及其含量保持不變，于10 L 發(fā)酵罐中恒溫發(fā)酵 7 d，測發(fā)酵液效價及發(fā)酵過程中pH 的變化趨勢。以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組。將培養(yǎng)好的二級種子液用壓差法移種于碳氮比不同的發(fā)酵罐，移種量10%，工藝控制參數(shù)：罐溫29.0±0.2℃ 罐壓0.06±0.002 MPa，空氣流量2.0～2.8 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速 200～650 r/min，DO≥45%。

1.2.2 泰樂菌素效價測定

1.2.2.1 標準曲線制備 稱取泰樂菌素標準品，用去離子水配制對照品溶液100 ml（濃度為1 000 u/ml），吸取對照液7.0 ml、6.0 ml、5.0 ml、4.0 ml、3.0 ml到10 ml容量瓶中用純化水定容至刻度，搖勻。再分別精密吸取1.0 ml到25 ml容量瓶中用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，搖勻，以0.1 mol/L HCl 為參比，在290 nm處測其吸光值。以吸光值為橫坐標，濃度為縱坐標繪制曲線，如圖1所示，曲線方程為y=42.577x+0.6621，其中R2=0.9961。

圖1 泰樂菌素標準曲線測定圖

1.2.2.2 發(fā)酵液泰樂菌素效價測定 取 50 ml 發(fā)酵液，加入2ml 20% Al2(SO4)3溶液進行絮凝，過濾；取過濾液，根據(jù)預估效價對濾液進行適當稀釋；吸取 1 ml 稀釋液于 25 ml 容量瓶內(nèi)，加入 0.1 mol/L HCl 定容，往復顛倒混勻，290 nm 下測 吸光值（0.1 mol/L HCl 為參比），根據(jù)標準曲線表結(jié)合稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中泰樂菌素含量。

1.2.3 發(fā)酵過程的pH測定 發(fā)酵過程中全程使用pH電極在線檢測pH值。

2 結(jié)果

2.1 氮源濃度對效價的影響

碳氮比對微生物的生長及代謝產(chǎn)物形成具有直接的影響，通過處理數(shù)據(jù)，作圖分析，如圖 2所示，發(fā)酵時間達到 149 h時，氮源濃度分別為10%、15%和 20%的培養(yǎng)基效價出現(xiàn)最高值，在166 h 效價出現(xiàn)下降的趨勢；而 0.5%和 5%以及 CK 組在166 h 效價處于最高值。其中，氮源含量為 5%的發(fā)酵液的效價較其他濃度顯著增高，與對照組相比提高了11.2%。

圖2 碳氮比對效價的影響圖

2.2 C/N 對 pH 的影響

發(fā)酵過程中各培養(yǎng)基的 pH 的變化如圖 3 所示，30 h 后 pH 在 34 h 和 36 h 時分別出現(xiàn)了峰值，此后pH呈現(xiàn)下降的趨勢，且隨著黃豆餅粉的含量的增加，pH峰值則依次增加。結(jié)合效價最高時培養(yǎng)基中黃豆餅粉的含量（5%），pH峰值出現(xiàn)在35 h，此時的 pH 值為 7.25。造成 pH 值出現(xiàn)峰值的原因與菌體自身的生長繁殖和代謝活動密不可分，發(fā)酵后期，隨著碳源的消耗殆盡，菌體繼續(xù)以氮源中的 C 作為自身生長所需的碳源，使發(fā)酵液中的含量增高，從而導致發(fā)酵液的pH值出現(xiàn)短暫的升高；30 h后菌體已經(jīng)開始大量形成代謝產(chǎn)物，參與菌體代謝產(chǎn)物的形成，因此出現(xiàn)了后期 pH 值下降的現(xiàn)象。

圖3 pH 比對效價的影響

3 討論

培養(yǎng)基的碳氮比對微生物生長及其產(chǎn)物的形成具有非常重要的影響。過量的氮源會促進菌體的生長，發(fā)酵液pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；而培養(yǎng)基中缺乏氮源則會降低菌體的繁殖量同樣影響產(chǎn)物的形成。碳源過量會導致發(fā)酵液 pH偏低，不利于菌體的生長繁殖；當培養(yǎng)基中缺乏碳源時，會引起菌體衰老和自溶。因此，適合的碳氮比對工業(yè)微生物的生長繁殖與產(chǎn)物形成具有重要的意義。

郝勃等[10]對篩選的高產(chǎn)泰樂菌素的弗氏鏈霉菌S1-1的培養(yǎng)基通過正交實驗得到了新的發(fā)酵配方，結(jié)果效價比原發(fā)酵配方提高了10.83%～16.53%，田宇[11]通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法對其篩選的高產(chǎn)菌株進行了培養(yǎng)基優(yōu)化，結(jié)果表明優(yōu)化后的培養(yǎng)基較其采用正交優(yōu)化的培養(yǎng)基提高了18.3%。通過以上可以看出，泰樂菌素發(fā)酵生產(chǎn)中不同碳源和氮源對泰樂菌素的效價影響較大，這與本實驗的結(jié)果相符，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持碳源（玉米粉）含量和其他成分及含量不變，改變氮源（黃豆餅粉）加入量，形成不同的C/N比，對比pH變化及效價高低，明確了在碳源保持不變的情況下，培養(yǎng)基中氮源的加量。

4 結(jié)論

本文通過改變氮源的含量控制發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，檢測發(fā)酵過程中pH的變化及發(fā)酵液效價，研究結(jié)果表明，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 5%的黃豆餅粉更有利于工業(yè)微生物形成代謝產(chǎn)物，提高發(fā)酵液效價。