貢松松，陸亞男，王 博，張 婧，吳劍平，嚴(yán) 鳳，曹 瑩

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題日益受到人們的關(guān)注。從蘇丹紅鴨蛋、三聚氰胺奶粉到瘦肉精“健美豬”事件，無(wú)一不牽動(dòng)著全國(guó)百姓的神經(jīng)。而重要原因就是濫用或非法使用獸藥或飼料添加劑，非法添加禁用物質(zhì)。歐盟出臺(tái)了相關(guān)法規(guī)，嚴(yán)格規(guī)定獸藥殘留限量，我國(guó)在這方面，也出臺(tái)了相關(guān)規(guī)定。雌激素殘留已成為引起兒童性早熟及相關(guān)癌癥等多發(fā)的潛在危害[1-3]。

雌激素目前檢測(cè)方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[4]和高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法[5]。氣相色譜質(zhì)譜法仍有缺陷，需要衍生化步驟，過(guò)程較為繁瑣。但高分辨質(zhì)譜（本文以四級(jí)桿高分辨為例）通過(guò)既可以獲得精確分子量信息又能獲得二級(jí)及多級(jí)特征碎片離子信息，使其在多殘留分析領(lǐng)域優(yōu)勢(shì)明顯[6,7]。本研究在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，改良QuEChERS[8-11]方法，建立一種快速篩查生鮮乳中7種雌激素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸（色譜級(jí)）美國(guó)天地公司；乙腈（色譜級(jí)）美國(guó)默克公司；乙酸（分析級(jí)）上海凌峰化學(xué)試劑公司；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉（分析級(jí)）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18）（美國(guó)安捷倫公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品（Hexestrol,HES）、雌酮標(biāo)準(zhǔn)品（Estrone,E1）、雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品（Estradiol,E2）、炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)品（Ethinylestradiol,EE2）、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品（Diethylstilbestrol,DES）、雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品(Estriol,E3)、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品（Dienestrol,DIE），純度均大于96.1%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。7種雌激素標(biāo)準(zhǔn)品見(jiàn)表1。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（6530，美國(guó)安捷倫公司）；MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）；Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)貝克曼公司）；多管漩渦振蕩器（北京踏錦公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；AE240電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：分別稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于7個(gè)10 ml的棕色容量瓶中，然后用甲醇溶液溶解并定容到10 ml，制備得到的單標(biāo)貯備液濃度為1mg/ml。為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和質(zhì)量控制樣品，使用時(shí)再根據(jù)需要混合或稀釋制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將所有的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液置于4 ℃冰箱低溫避光保存。

1.4 樣品前處理

稱(chēng)取5.0 g生鮮乳樣品，置于50 ml離心管中，加入20 ml 乙腈，渦旋振蕩1 min，稱(chēng)取1.0 g氯化鈉和4.0 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋震蕩4 min，9 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取10 ml上層清液于離心管中，加入1.0 g無(wú)水硫酸鈉，0.2 g PSA，渦旋振蕩器振蕩 4 min，9 000 r/min離心5 min，取5 ml上層清液于40 ℃氮?dú)獯抵两?，?.0 ml乙腈-水溶液（5∶95，V/V）定容，渦旋30 s，過(guò)0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定。

表1 7種雌激素類(lèi)藥物的名稱(chēng)、分子式、CAS號(hào)、保留時(shí)間、理論分子量、實(shí)測(cè)分子量、質(zhì)量誤差以及質(zhì)譜碎片離子信息

1.5 超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0 min，5% B；2 min，5% B，2～4 min，5%～40% B；4～7 min，40%～80% B；7～7.5 min，80%～9 5% B；7.5～1 2 min，95%～95%B；12～13 min，95%～5%B；13～15 min，5%B；柱溫：35 ℃；流速：0.3 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

1.5.2 質(zhì)譜條件 干燥氣流速：8 L/min；干燥氣溫度：320 ℃；陰離子模式；掃描范圍：50～1 000 m/z；霧化器壓力：35 psig；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：500 V；飛行時(shí)間管真空度：2.04×10-7；碎裂電壓：130 V；儀器在高分辨率（4 GHz），低質(zhì)量范圍（＜m/z 1 700）下操作。7種雌激素類(lèi)藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)和提取離子色譜圖分別見(jiàn)表1、圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 為考察不同色譜柱的影響，本研究選取了SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、SB C18（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）和Extend C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）3種色譜柱。研究發(fā)現(xiàn)，第一種色譜柱SBC18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）分離效果最好，因?yàn)樵叫〉膬?nèi)徑，峰形相對(duì)越對(duì)稱(chēng)尖銳。柱長(zhǎng)會(huì)影響保留時(shí)間，雖然5 cm比10 cm保留時(shí)間更短，但是有些藥物峰形較差。因此，如圖1所示，選用內(nèi)徑更小的10 cm色譜柱，分離度更好，更有利于后續(xù)分析。

圖1 7種雌激素類(lèi)藥物的提取離子色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 為考察不同藥物分離效果的影響因素，本研究選取水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液分別考察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入甲酸或者乙酸時(shí)，藥物峰形不對(duì)稱(chēng)，分離度較差。當(dāng)不加酸僅用超純水時(shí)，峰形較好。最終流動(dòng)相選擇乙腈和水，結(jié)合梯度洗脫方式，7種藥物分離度較好。

2.1.3 梯度洗脫條件的優(yōu)化 因?yàn)槟繕?biāo)藥物的極性差異較大，采用梯度洗脫是最佳選擇。本研究通過(guò)改變有機(jī)相在初始流動(dòng)相中的比例（5%、10%、20%）和不同洗脫時(shí)間（12 min、15 min、20 min）對(duì)洗脫效果進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈的初始比例為5%時(shí)種雌激素類(lèi)藥物能緩慢洗脫下來(lái)，結(jié)合避免色譜柱上的藥物殘留和沖洗時(shí)間，最終選擇5%乙腈作為初始流動(dòng)相，洗脫時(shí)間15 min。

2.1.4 定溶液的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品進(jìn)樣前的定溶液對(duì)目標(biāo)藥物的分離效果和離子化效率具有很大影響。因此比較了超純水、乙腈一水（5∶95，V/V）、乙腈一水（20∶80，V/V）、乙腈一水（5 0 ∶5 0，V/V）和乙腈一水（90∶10，V/V）作為不同定溶液的影響，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始流動(dòng)相中有機(jī)相的比例不小于定溶液時(shí)，峰形較好且對(duì)稱(chēng)。當(dāng)初始流動(dòng)相中有機(jī)相的比例小于定溶液時(shí)，目標(biāo)藥物峰形變寬，分離效果較差。因此，最終實(shí)驗(yàn)選擇乙腈一水（5∶95，V/V）作為定溶液。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

陰離子模式下，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜全掃描可以獲得目標(biāo)藥物的總離子色譜圖。逐個(gè)選擇各個(gè)藥物的提取離子色譜圖，依據(jù)響應(yīng)和峰形，依次對(duì)噴嘴電壓等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最后對(duì)碎裂電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的相關(guān)參數(shù)。最后參數(shù)見(jiàn)1.5.2。

表2 7種目標(biāo)藥物的基質(zhì)效應(yīng)、線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1 QuEChERS提取步驟的優(yōu)化 所有的目標(biāo)藥物為了都能提取到，提取溶液選擇了不同酸度的乙腈進(jìn)行研究，具體為：乙腈、0.1%的甲酸乙腈、1%的甲酸乙腈、0.1%的乙酸乙腈、1%的乙酸乙腈。研究表明，最后4組的兩種藥物回收率太低，雙烯雌酚和己烷雌酚小于30%，且可能出現(xiàn)假陰性，己烯雌酚無(wú)法檢出，第一組藥物回收率總體滿(mǎn)意，所有藥物介于60%和120%之間，因此，最終選擇乙腈作為QuEChERS提取溶劑。

2.3.2 QuEChERS凈化步驟的優(yōu)化 為了去除農(nóng)殘，針對(duì)果蔬中脂肪酸色素等物質(zhì)，傳統(tǒng)的QuEChERS方法選擇PSA作為吸附劑，但生鮮乳本身更加復(fù)雜，如不加去除，大量的脂肪和蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾。PSA和C18都可用于去除這些干擾成分，但是在凈化的同時(shí)，目標(biāo)藥物有可能被吸附，所以要對(duì)二者進(jìn)行必要的優(yōu)化。如圖2所示，研究發(fā)現(xiàn)，分析所有藥物的回收率，C18組兩種藥物低于50%，與之相比，選擇PSA用于凈化，所有藥物回收率介于60%～120%之間，故最終選擇PSA用于QuEChERS凈化。

圖2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的回收率實(shí)驗(yàn)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

表3 7種目標(biāo)藥物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍 由于生鮮乳基質(zhì)的復(fù)雜性，因此要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。分別選擇空白生鮮乳樣品基質(zhì)溶液和初始流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。基質(zhì)效應(yīng)ME=k1/k2×100%計(jì)算。其中k1、k2分別是兩套標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌三醇基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯，3種藥物基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯。本研究最終使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法用于定量。

2.4.2 檢出限（LOD）與定量限（LOQ）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最低濃度用空白樣品基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋?zhuān)魉幬锏亩ㄐ詸z出限，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算，以10倍儀器檢測(cè)信噪比（S/N=10）計(jì)算定量限，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)藥物L(fēng)OD為5～20 μg/kg，LOQ為10～50 μg/kg。相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.4.3 回收率與精密度 將低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加在空白生鮮乳樣品中，平行測(cè)定6次，統(tǒng)計(jì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及計(jì)算平均回收率。結(jié)果表明，目標(biāo)藥物的回收率為 63.5%～ 115.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～11.4%。相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

2.5 實(shí)際樣品的篩查

利用已建立的方法初次對(duì)來(lái)自全國(guó)的80份生鮮乳樣品進(jìn)行篩查，對(duì)可疑數(shù)據(jù)結(jié)合二級(jí)特征碎片離子比對(duì)，檢出了不同含量的雌三醇、雌酮。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，作為天然激素，雌三醇、雌酮本身就是奶牛體內(nèi)的內(nèi)源性激素。

3 結(jié)論

本研究建立了一種高分辨質(zhì)譜快速篩查與確證生鮮乳中雌激素類(lèi)藥物的方法。改進(jìn)了前后處理方法，快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，可作為該類(lèi)藥物的篩查方法。