魏學(xué)盛，邵鵬陽，姚亞莉，姜芳霞，李明娜*，楊 耀

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘南州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 合作 747000）

雌性動(dòng)物生殖器官包含卵巢、輸卵管、子宮、陰道及外陰部。卵巢能夠排出卵子，決定卵子的質(zhì)量及數(shù)量。因此很多學(xué)者集中于卵巢的結(jié)構(gòu)及生理功能進(jìn)行研究。然而，子宮與輸卵管的作用也至關(guān)重要。子宮與輸卵管相連，為中空的管道，是卵子和精子運(yùn)行、受精、早期胚胎發(fā)育、附植及胎兒妊娠的主要場(chǎng)所[1]；同時(shí)子宮上皮也能夠分泌激素，調(diào)控卵巢周期性活動(dòng)。因此研究子宮與輸卵管的結(jié)構(gòu)有助于更深入了解雌性動(dòng)物繁殖機(jī)理。

隨著生物學(xué)研究由體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向體內(nèi)，小鼠目前成為廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這與小鼠體積小、生長(zhǎng)周期短、易于飼養(yǎng)、成本低等優(yōu)勢(shì)息息相關(guān)。因此通常選擇小鼠作為研究人和哺乳動(dòng)物生理、繁殖和病理現(xiàn)象的理想模型[2]。

本實(shí)驗(yàn)選取幼齡和成年小鼠的子宮和輸卵管為研究對(duì)象，制作石蠟切片，HE方法染色，比較幼鼠和成鼠子宮和輸卵管的形態(tài)學(xué)差異，以期闡明子宮和輸卵管的發(fā)育規(guī)律，為深入了解小鼠生殖器官的生理功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取10只4周齡和10只8周齡SPF清潔級(jí)雌性小鼠，均購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所。飼養(yǎng)3 d無異常后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及耗材

伊紅、蘇木精、中性樹膠購(gòu)自索萊寶生物公司；甲醛、乙醇、二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石蠟購(gòu)自上海華靈康復(fù)器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

脫水機(jī) KEDEE KD-TS3A，攤片機(jī) KEDEE KD-P，烘片機(jī) KEDEE KD-H，普通光學(xué)顯微鏡，切片機(jī) LEICA RM2235等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 組織固定 飼養(yǎng)3 d后，選取體重相近的成年小鼠（32.42±2.75 g）和幼年小鼠（24.45±2.65 g）各6只，做好標(biāo)記。斷頸法處死小鼠，分離出小鼠子宮和輸卵管，浸入4%甲醛固定液中，使組織蛋白質(zhì)變性并防止胞死亡后自溶或細(xì)菌分解。

1.4.2 流水 將組織從固定液中取出，放在微水流中流水沖洗12 h。

1.4.3 脫水透明 用不同濃度酒精（從低到高）作為脫水劑，逐步脫去組織中的水分，再將組織置于二甲苯中透明，以二甲苯替換組織中的酒精。本步驟借助自動(dòng)KEDEE KD-TS3A脫水機(jī)進(jìn)行脫水透明，具體濃度與時(shí)間如下：酒精（75%）45 min，酒精（85%）45 min，酒精（95%）45 min，酒精（95%）45 min，酒精（100%）45 min，酒精（100%）30 min，二甲苯酒精30 min，二甲苯7 min，二甲苯7 min，二甲苯石蠟45 min，石蠟45 min，石蠟45 min。

1.4.4 浸蠟與包埋 將自動(dòng)脫水機(jī)內(nèi)的組織取出，按合適的方位置于模具中，緩慢倒入已經(jīng)融化好的石蠟。整個(gè)過程要求迅速、平穩(wěn)。

1.4.5 切片與貼片 將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成5 um薄片。將切下的薄片放至25℃的水中攤平，再貼至載玻片上（此過程要求動(dòng)作輕緩，不產(chǎn)生氣泡為宜）。最后將載玻片置于45℃的烘片機(jī)上烘干。

1.4.6 脫蠟染色 將烘干的切片進(jìn)行脫蠟，采用蘇木精-伊紅（HE）方法進(jìn)行染色，具體操作過程如下：二甲苯5 min，二甲苯5 min，苯乙醇3 min，100%乙醇2 min，100%乙醇2 min，80%乙醇2 min，蒸餾水2 min，蘇木精染色液30 s，蒸餾水1 min，分化液（1%鹽酸+99%乙醇）2 s，蒸餾水30 s，0.5%伊紅染色液30 s，80%乙醇2 s，95%乙醇2 s，95%乙醇2 s，100%乙醇2 s，100%乙醇2 s，二甲苯2 mi n，二甲苯2 min，最后用玻璃棒蘸取適量中性樹膠于載玻片上，蓋上蓋玻片待凝固后觀察結(jié)果。

1.4.7 鏡檢 將制作好的切片置于顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠子宮的組織結(jié)構(gòu)觀察

家畜子宮分為子宮角、子宮體和子宮頸三部分組成。從子宮頸前端到子宮基部為子宮體。子宮頸前端與子宮體內(nèi)相通，后端突入陰道內(nèi)稱為子宮頸陰道部。從組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次為漿膜、肌層及黏膜。子宮漿膜與子宮闊韌帶的漿膜相連接。子宮黏膜由上皮和固有膜構(gòu)成，上皮陷入固有膜構(gòu)成子宮腺。小鼠與家畜不同，為雙子宮，呈“Y”型。左右子宮角匯合至子宮體，形成兩個(gè)獨(dú)立的子宮，再向外匯合形成子宮頸。如圖1所示，小鼠的子宮內(nèi)膜腔上皮由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，被大量的基質(zhì)細(xì)胞所包圍[3]。固有膜又稱為基質(zhì)膜，含有大量的淋巴、血管及子宮腺。子宮腺為簡(jiǎn)單、分支、盤區(qū)的管狀腺，其中子宮腺以子宮角最為發(fā)達(dá)，子宮體較少。子宮內(nèi)膜被平滑肌所構(gòu)成的子宮肌層所包圍，形成子宮邊界。肌層外層薄，為縱行肌纖維，內(nèi)層厚，為螺旋形的環(huán)狀肌纖維。

圖1 小鼠子宮組織切片圖

2.2 幼鼠與成鼠子宮結(jié)構(gòu)比較

幼鼠與成鼠子宮切片進(jìn)行比較，可以看出子宮結(jié)構(gòu)，形態(tài)存在很大差異（見圖2）。成年小鼠子宮內(nèi)膜褶皺多于幼年小鼠，子宮黏膜面積也較幼鼠大。內(nèi)膜中子宮腺的數(shù)量也是成年小鼠多于幼年小鼠，這可能與成鼠完善的生殖功能有關(guān)。

圖2 成年與幼年小鼠子宮角切片圖

2.3 小鼠輸卵管組織形態(tài)觀察

輸卵管是卵子進(jìn)入子宮的必經(jīng)之道，包在輸卵管系膜內(nèi)，形狀彎曲。輸卵管的管壁從外向內(nèi)由漿膜、肌層和黏膜構(gòu)成（見圖3）。肌層可分為內(nèi)層的環(huán)形或螺旋形肌束和外層的縱行肌束（見圖4），其中有斜行纖維，使整個(gè)管壁能協(xié)調(diào)地收縮。肌層從卵巢端到子宮端逐漸增厚，黏膜形成若干縱璧。黏膜上分布有柱狀纖毛細(xì)胞和無纖毛的楔形細(xì)胞[4]（見圖4）。纖毛細(xì)胞在輸卵管的卵巢端，特別是在輸卵管的傘部，較普遍，子宮端較少。無纖毛楔形細(xì)胞為分泌細(xì)胞，含有特殊的分泌顆粒，其大小和數(shù)量在不同種間和發(fā)情的不同時(shí)期有著很大的變化。分泌的黏蛋白和黏多糖，可供給早期胚胎營(yíng)養(yǎng)，且結(jié)構(gòu)和分泌機(jī)能也受卵巢激素的調(diào)節(jié)。

圖3 成年小鼠輸卵管組織切片圖

圖4 成年小鼠輸卵管組織切片局部圖

2.4 幼鼠與成鼠輸卵管結(jié)構(gòu)比較

幼鼠與成鼠輸卵管切片比較，成鼠黏膜較發(fā)達(dá)。幼鼠輸卵管縱壁較成鼠少，且直；相反成鼠輸卵管中縱壁多而彎，還有不同程度的分支現(xiàn)象。成鼠每個(gè)縱壁黏膜上皮的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞較多，細(xì)胞小而密，同時(shí)纖毛分布較多；幼鼠中這兩類細(xì)胞較大，細(xì)胞核明顯，分布疏松（見圖5）。

圖5 成年與幼年小鼠輸卵管切片圖

3 討論

動(dòng)物到達(dá)初情期后，能夠排出有受精能力的精子或卵子，然而生殖器官還未成熟[5]，因此不能作種用。本研究中比較幼鼠和成鼠的子宮和輸卵管形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)子宮黏膜和輸卵管黏膜都存在很大差異，包括腺體的數(shù)量、子宮內(nèi)膜褶皺及輸卵管縱壁等，表明幼鼠至成鼠生長(zhǎng)過程中，生殖器官也持續(xù)發(fā)育，結(jié)構(gòu)趨于成熟，功能趨于完善。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中常見對(duì)幼畜實(shí)施超數(shù)排卵，以得到一定量的具有受精能力的卵子，后通過體外成熟、體外受精，將質(zhì)量較好的胚胎移植入成年雌性動(dòng)物體內(nèi)妊娠，縮短世代間隔，加快育種進(jìn)程。

成鼠子宮腔上皮較幼鼠發(fā)達(dá)，一方面向子宮腔延伸，另一方面向子宮內(nèi)膜延伸形成更多腺體；整體看來子宮內(nèi)膜褶皺增多。同時(shí)成鼠輸卵管縱襞也較幼鼠發(fā)達(dá)，纖毛細(xì)胞和分析細(xì)胞數(shù)量增多。以上結(jié)構(gòu)均為卵子的運(yùn)行提供方便。卵子排出后在輸卵管中運(yùn)行，依靠輸卵管黏膜的纖毛擺動(dòng)及輸卵管管壁的收縮將卵子輸送向前；受精后的受精卵到達(dá)子宮后，同樣依靠子宮內(nèi)膜褶皺的蠕動(dòng)及子宮壁的收縮運(yùn)動(dòng)。因此，成年小鼠的子宮和輸卵管結(jié)構(gòu)完善，具備卵子受精及妊娠的生理環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究初步對(duì)成年和幼年小鼠子宮和輸卵管進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)成鼠子宮腔上皮較幼鼠發(fā)達(dá)，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完善；輸卵管縱壁結(jié)構(gòu)分支明顯，細(xì)胞分布緊密，纖毛數(shù)量多。