霍藍青，王曉雨，宗麗菊，向 陽，楊雋鈞**

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 a.婦產科;b.病理科,北京 100730；2.中山大學腫瘤防治中心放療科，廣州 510060)

絨毛膜癌(絨癌)是由具有侵襲性的、富含血管的和間變性的滋養(yǎng)層組織構成的惡性腫瘤，含有細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞，無絨毛結構，具有高度侵襲性，多發(fā)于育齡期婦女。由于有效化療藥物的應用，低危絨癌患者治愈率接近100%，合并轉移的高?；颊叩闹斡室策_90%。多數(shù)患者可通過單藥或多藥化療獲得完全緩解，部分患者可通過手術切除化療耐藥的病灶，但仍有10%～20%的患者因耐藥死亡[1-2]。血清β-HCG水平對絨癌診斷、治療方案選擇、療效監(jiān)測以及治療后隨訪等均具有重要作用，但對于耐藥的機制以及如何提高耐藥患者療效方面仍是當今研究的重點。CD105是轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的受體超家族成員之一，目前針對CD105的研究主要在血管內皮細胞和抗血管生成治療。BMP9是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)中的一員，BMPs是TGF-β超家族成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)該蛋白參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。本課題組前期關于絨癌患者病理組織的研究中，已發(fā)現(xiàn)CD105和BMP9在細胞型和合體型滋養(yǎng)細胞表達呈正相關。本研究旨在從裸鼠移植瘤角度驗證CD105過表達和敲減表達對BMP9及其上下游Smads通路中蛋白表達的影響，以及其對荷瘤組織生長和耐藥的影響，旨在為絨癌耐藥機制的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 人絨毛膜上皮癌細胞JEG-3購自ATCC(美國模式菌種收集中心)，JEG-3/CD105 OE與JEG-3/shCD105分別為帶有EGFP熒光和嘌呤霉素(puro)抗性基因標記的human ENG(CD105)過表達細胞系和敲減細胞系，其慢病毒載體及對應空載體的包裝及濃縮均由上海和元生物技術公司完成，前期已通過細胞實驗驗證細胞株成功構建。4～6周齡體重為18～20g的雌性BALB/c裸鼠90只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，隨機分為3組:JEG-3細胞(野生組)、JEG-3/CD105 OE(過表達組)與JEG-3/shCD105(敲減表達組)。

1.2 實驗試劑 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.05%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，注射用甲氨蝶呤粉針(江蘇恒瑞，1g)，生理鹽水、4%多聚甲醛固定液、二甲苯、無水乙醇，CD105、BMP-9、P-smad1/5/8、P-smad2、P-smad3(Abcam，蛋白印跡一抗、免疫熒光一抗)，CD105-ELISA試劑盒(eBioscience-BMS2105INST)。

稅收籌劃的發(fā)展和創(chuàng)新都是伴隨著國家稅收政策的變化而更新，利用稅收政策的變化，在合理的范圍內將經營活動進行合理安排和重新規(guī)劃，為企業(yè)尋求更大的利益。稅收人員應該密切關注國家政策的變動，抓住為企業(yè)提高經濟利益的機會。同時，應當充分解讀稅收法律法規(guī)以及新的政策，降低稅收籌劃失敗的風險。

1.3 實驗器材 游標卡尺、脫色搖床、顯微鏡、Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)、全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)、全自動生化儀(AU480，Japan)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)。

1.4.3 觀察方案 觀察A組中野生型、過表達型和敲減表達型裸鼠的移植瘤生長情況，具體觀察項目包括：(1)生命體征:隔天觀察各組裸鼠對外界刺激的反應、飲食、體重等變化;(2)移植瘤形態(tài):隔天觀察移植瘤的表面形態(tài)、觸感、活動度、硬度以及破潰情況;(3)移植瘤的生長特點:從化療開始的第1天，即用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑(a)、短徑(b)，隔天測量并記錄,按腫瘤體積計算公式(V=a×b2/2)計算腫瘤體積的平均值，繪制移植瘤的生長曲線。計算體積抑瘤率=[(1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積)×100%];(4)移植瘤重量:在化療周期的第17天(即?；煹牡?2天),用頸椎脫臼法處死裸鼠,完整剝取移植瘤組織,測量移植瘤重量。計算質量抑瘤率=[(1-實驗組腫瘤質量/對照組腫瘤質量)×100%]，通過抑瘤率反應MTX的化療效果。

2.2.2 免疫組化檢測結果 過表達型移植瘤的CD105、BMP9等蛋白的表達水平均高于野生型和敲減表達型移植瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而p-smad2、3、1/5/8等蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義,見表2、圖4。

2.2.1 Western blot檢測結果 過表達型移植瘤的CD105、BMP9、p-smad2、3、1/5/8蛋白表達水平均高于野生型和敲減表達型移植瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖3。

1.4.2 分組與給藥 (1)比較各組移植瘤對甲氨蝶呤的耐藥情況：含野生型、過表達型和敲減表達型細胞系移植瘤各20只(A組)。各型10只為實驗組，10只為對照組。實驗組：腹腔注射甲氨蝶呤(MTX)按鼠重給藥,1.0μg/(g·d)，共5日；對照組：每日腹腔注射等劑量生理鹽水，共5日。(2)比較各組移植瘤蛋白表達情況：含野生型、過表達型和敲減表達型細胞系移植瘤各10只(B組)。不予腹腔注射，待接種34天后將野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤裸鼠處死，取血清及瘤體。

在一般人看來，小組合作學習就是相互幫助。實驗證明，小組合作的任務是相互監(jiān)督、相互檢查、相互幫助。首先是相互監(jiān)督，不學有人管；其次是相互檢查，不管是讀課文還是書面練習，都是二人一組相互交換檢查；最后有不會的問題才是相互幫助。小組要實行捆綁式評價，形成一個戰(zhàn)斗團隊。

1.4.4 免疫組化法檢測 取A組中野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤組織標本，每份標本均分為兩份:一份離體后迅速置于液氮中凍存后用于Western blot檢測；一份經4%多聚甲醛固定液固定后用石蠟包埋切片。隨后行脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、BSA封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。使用軟件Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)行免疫組化累積光密度值(IOD)分析。每組內每張切片指定的3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析，得出每張照片陽性的平均光密度值(MOD)，累積光密度(IOD SUM)。

1.1.3 普通疾病動物的普通病包括多種，比如內科、外科或者是產科疾病，而且發(fā)病率極高。外科疾病主要包括外傷或者是眼病等等，產科疾病較為復雜，包括孕期、分娩期以及產后的相關疾病等。

2.1.1 總體情況 于接種野生型、過表達型和敲減表達型細胞懸浮液第14～21天，觀察到注射部位有移植瘤結節(jié)生長,成瘤率100%。移植瘤呈快速外生型生長，早期為橢球形，質軟，結節(jié)狀，覆其表面皮膚為紫黑色，晚期瘤體有破潰，剝離瘤體時，內有大量淤血。

1.4.5 Western blot法檢測 取B組標本勻漿處理，取上清。配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%，待檢測蛋白樣品上樣量為35μg/孔，轉膜、染色、5%BSA-TBST封閉、一抗孵育過夜、次日洗膜、膠片曝光、顯影定影。

1.4.6 ELISA法測血清濃度 收集B組裸鼠血清，按eBioscience-BMS2105INST說明書準備標準品和待測樣本。將標準品和待測樣本放入自動酶標儀測定450nm波長處的吸光度(OD)值，參比波長620nm。求標準曲線，并根據(jù)標準曲線公式計算各樣本的sCD105濃度。

2 結 果

2.1 裸鼠移植瘤的生長情況

臨危受命，陳頤磊多少有點壯懷激烈的感覺，他從顧祝同手里接過委任狀，轉身向屬下敬了禮：“陳某不才，恐難肩此大任，但我心昭日，誓與全軍官兵同生死，城在我在！城破我亡！”

2.1.2 移植瘤生長情況的比較 在第17天時，取野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤中體積大于100mm3裸鼠各20只，分亞組予以處理，分別予以MTX單藥化療注射5天和生理鹽水注射5天對照。在各型移植瘤生長中，注射MTX的移植瘤生長速度明顯慢于注射生理鹽水的移植瘤；而在同等處理情況下，過表達型移植瘤生長速度在同一時間點均快于野生型移植瘤和敲減表達型移植瘤。MTX單藥化療對過表達型移植瘤的抑瘤率明顯低于野生型和敲減表達型移植瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1～2。

圖1 野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤生長曲線(MTX:化療;NS:對照)

圖2 第30天野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤(箭頭所指為瘤體位置)

2.1.3 瘤重量及抑瘤率的比較(取化療結束后14天各組平均值) 野生型組平均重量抑瘤率為(42.23±2.33)%，體積抑瘤率為(42.79±3.64)%，過表達型組(2只因瘤負荷過重死亡)平均重量抑瘤率為(31.03±5.76)%，體積抑瘤率為(26.05±4.97)%，敲減表達型中平均重量抑瘤率為(56.00±3.15)%，體積抑瘤率為(56.51±5.32)%。

2.2 裸鼠移植瘤的CD105、BMP9、p-smad2、3、1/5/8蛋白表達水平

1.4.1 絨毛膜癌裸鼠移植瘤模型建立 取對數(shù)生長期絨毛膜癌JEG-3細胞(野生型)、JEG-3/CD105 OE(過表達型)與JEG-3/shCD105(敲減表達型)消化、懸浮吹吸后，顯微鏡下觀察活細胞數(shù)>95%時進行細胞計數(shù)，用無菌生理鹽水配置細胞懸浮液至細胞密度約107/mL(根據(jù)預實驗設置濃度梯度后，107/mL為最佳濃度，預實驗該濃度下成瘤率100%)。按無菌原則，于每只裸鼠頸部上方皮下注射0.2mL細胞懸浮液，每種細胞系接種30只。觀察移植瘤潛伏期，待每組腫瘤大小平均達100mm3時，統(tǒng)計成瘤率，各組分為兩個亞組進行后續(xù)用藥試驗。

表1 野生型、過表達型和敲減表達型細胞移植瘤Western blot灰度分析

圖3 Western blot法檢測CD105、BMP9、p-smad2、3、1/5/8細胞蛋白表達

1.4 實驗方法

甲氨蝶呤單藥化療是目前治療低危滋養(yǎng)細胞腫瘤患者的一線治療方案之一。對化療藥物耐藥是困擾絨癌治療的主要瓶頸，目前國內外對絨癌耐藥發(fā)病機制的相關基礎研究正處于探索階段。

圖4 野生型、過表達型和敲減表達型移植瘤CD105、BMP9、p-smad3及p-smad1/5/8表達水平(×20)

表2 3組裸鼠移植瘤中各蛋白表達水平的比較

表3 野生型、過表達型和敲減表達型裸鼠血清平均CD105濃度的比較

3 討 論

2.2.3 ELISA檢測野生型、過表達型和敲減表達型裸鼠血清CD105濃度 過表達型裸鼠的血清CD105濃度明顯高于野生型和敲減表達型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

因此，在電熔焊接PE管道施工中建議隨機抽取5%的電熔連接件進行拉伸剝離試驗，這樣能有效地控制焊接質量，盡量避免虛焊的出現(xiàn)，從而保證管道達到設計使用壽命。

CD105作為一種新型的腫瘤血管內皮標記物，其在評價腫瘤血管生成和預后上具有較好的特異性，以CD105為靶點的抗腫瘤血管治療也陸續(xù)進入了臨床試驗[3]。然而，在乳腺癌、卵巢癌等實體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CD105不僅在腫瘤血管內皮細胞中表達上調，在腫瘤實質細胞中也有較高表達，并與不良預后相關[4-8]。抑制CD105表達可起到抗腫瘤生成作用，提示CD105除了具有促血管生成作用外，在腫瘤演進的過程中可能還有更廣泛的作用。目前尚無CD105及相關通路在絨癌耐藥中的研究報道。

BMP9屬于TGF-βs超家族成員之一，作為一種多效性細胞因子，在骨的再生、軟骨形成、血管生成、腫瘤的發(fā)生及骨轉移等多種方面發(fā)揮重要作用[9]。TGF-βs主要通過經典的Smads信號通路傳遞信號，調節(jié)下游靶基因的轉錄而發(fā)揮其生物學功能。目前絕大多數(shù)研究提示BMP9主要通過Smad1/5/8磷酸化發(fā)揮生物學效應，但在肺的微血管內皮細胞中BMP9同樣可引起Smad2磷酸化，而這種激活作用可能與不同的BMP9受體相關[10-11]。Cunha等[12]研究發(fā)現(xiàn)，BMP9可增強TGF-β1誘導的Smad2磷酸化以及Smad3介導的轉錄反應，該信號通路的作用在絨癌細胞系中也得到驗證[13]。而在內皮細胞中，TGF-β1/Smad2/3通路則起到與BMP9/Smad1/5/8通路相拮抗平衡的作用。

第三方移動支付作為遠程電子結算方式具有信息不對稱的特點，往往增加買方錢貨兩空的風險，第三方支付的消費者常常面臨釣魚欺詐問題和電信詐騙，犯罪分子常編造各種理由、利用虛假身份、用盜號軟件來騙取支付寶支付驗證碼，冒用被害人支付寶轉賬套現(xiàn)，騙取資金。當代大學生初入社會，不具備強烈的自我保護意識和法律意識，常常會遇到電子信息詐騙、網絡詐騙、校園貸等騙局。

有研究通過對化療后接受全子宮切除術的絨癌患者病理組織免疫組化染色和臨床病理意義分析，發(fā)現(xiàn)殘存滋養(yǎng)細胞中CD105和BMP9的表達一致，其表達水平與患者治療后復發(fā)有關，提示CD105和BMP-9可能成為獨立于β-HCG之外的預測患者預后的指標[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗CD105單抗聯(lián)合化療對復發(fā)難治絨癌患者有顯著療效[15]。

綜上所述，hTERT過表達在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，刪除或阻抑hTERT功能可作為卵巢癌綜合治療的有效輔助手段之一。hTERT作為卵巢癌新的診斷和治療靶點，還有待于進一步研究開發(fā)。

本研究在成功構建CD105表達相關的裸鼠移植瘤模型后，通過對各組移植瘤的生長和其蛋白表達檢測，發(fā)現(xiàn)CD105敲減表達移植瘤生長速度明顯落后于絨癌野生株移植瘤；而CD105過表達移植瘤生長速度明顯快于野生株移植瘤。而在抑瘤率方面，甲氨蝶呤對過表達移植瘤生長的抑制作用明顯弱于野生株，對敲減表達移植瘤生長的抑制作用明顯強于野生株，進一步驗證了絨癌中CD105與腫瘤生長速度和耐藥程度呈正相關。在同等處理下，移植瘤中CD105、BMP9的表達水平與裸鼠血清中CD105表達水平呈正相關，而與甲氨蝶呤化療療效呈負相關。血清游離CD105水平與瘤體CD105水平具有一致性，這表明血清游離CD105或可作為biomarker篩選使用靶向抗體治療潛在獲益的患者，進一步提示了BMP9和CD105對絨癌耐藥的機制有著重要意義。

本課題組前期細胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，CD105通過調控BMP9/Smads通路參與絨癌細胞耐藥過程，但本次實驗中關于BMP9下游可能的作用靶點的蛋白表達量測定尚未得出明確相關性。瘤體病理組織中BMP9與Smads通路蛋白相關性未能完全驗證體外實驗結果，可能原因：(1)體內BMP-9主要通過共通路型Smads家族中除Smad1/5/8外的通路介導絨癌耐藥；(2)體內BMP9可能通過抑制型Smads或受體調節(jié)型Smads介導相關蛋白表達；(3)與Smad1/5/8、Smad3以及Smad2等蛋白在體內外磷酸化具體機制差異相關；(4)與瘤體組織中殘余血量較多有關，需后續(xù)實驗深入研究。

綜上所述，本研究結果證實了在裸鼠絨癌移植瘤模型中，CD105參與了絨癌化療耐藥，并對瘤體生長速度產生影響，該模型中CD105可能通過BMP9/Smads通路發(fā)揮作用，具體下游信號通路還有待研究，血清游離CD105或可作為使用靶向抗體治療潛在獲益的篩選手段。靶向CD105及BMP9的相關藥物有望成為治療絨癌耐藥的新選擇。