樓 華,魏 曉,周東晨,馬晶晶,徐 滔,高慶蕾
(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430030)
卵巢癌的死亡率居婦科惡性腫瘤首位[1]。造成這一結(jié)果的因素很多,包括早期癥狀不明顯、易于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及缺乏長期有效的化療[2]。高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSOC)在所有卵巢癌中惡性程度很高,易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移,常引起嚴(yán)重腹水和腸梗阻,造成患者死亡。越來越多的證據(jù)開始支持肥胖在卵巢癌發(fā)生中的作用:兩項流行病學(xué)研究已建立了卵巢癌和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)之間的聯(lián)系[3-4]。瘦素(leptin)是肥胖女性體內(nèi)異常分泌的脂肪因子,肥胖患者的血清瘦素水平升高。瘦素通過其受體起作用,該受體由LEPR基因編碼。腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的多步驟過程,上皮癌細(xì)胞為了遷移和侵襲,必須經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。瘦素受體(leptin receptor,LEPR)與一些細(xì)胞因子有結(jié)構(gòu)上的同源性,包括已知參與卵巢癌細(xì)胞EMT的IL-6。LEPR已經(jīng)在幾種上皮性癌癥中被發(fā)現(xiàn),包括肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。在這些癌癥中,瘦素與LEPR結(jié)合后,JAK/STAT、MAPK和PI3K/Akt信號通路隨之激活,導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和遷移[5-8]?;诖耍狙芯坎捎妹庖呓M化法和生物信息學(xué)分析原發(fā)病灶與轉(zhuǎn)移病灶之間LEPR的表達(dá)差異,初步探討LEPR介導(dǎo)肥胖HGSOC轉(zhuǎn)移的機制,為LEPR可能成為新的治療靶點提供依據(jù)。
1.1 臨床資料 收集2017年9月至2019年10月10例卵巢癌病例的原位病灶和轉(zhuǎn)移病灶。納入標(biāo)準(zhǔn):BMI≥25kg/m2,病理類型為HGSOC,用于免疫組化染色。收集2012年3月至2016年7月5例HGSOC病例的原位病灶、腹水和轉(zhuǎn)移病灶,用于基因芯片表達(dá)譜分析。所有標(biāo)本均在患者知情同意、經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會授權(quán)并經(jīng)兩名資深醫(yī)學(xué)家評估的情況下在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院婦科腫瘤采集。
1.2 研究方法
1.2.1 免疫組化染色及評分 瘦素受體多克隆抗體(SC-1834)購自Santa Cruze公司;SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢大風(fēng);二胺基聯(lián)苯氨(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋。石蠟切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟、乙醇梯度水化、阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性、抗原修復(fù)和封閉、一抗4℃過夜。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP法)進(jìn)行免疫組化染色,光鏡下控制DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、封片。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照,以脂肪組織的染色結(jié)果作為陽性對照。LEPR陽性細(xì)胞為胞膜和(或)胞漿染成棕黃色。染色結(jié)果為兩位病理學(xué)家的平均得分。對組織中LEPR蛋白水平進(jìn)行半定量評估:染色強度評分(0分,陰性;1分,弱陽性;2分,中等陽性;3分,強陽性);陽性染色細(xì)胞所占總腫瘤細(xì)胞百分比評分(0分,無陽性細(xì)胞;1分,≤10%;2分,11%~25%;3分,26%~50%;4分,≥51%)。每片選擇5個不重復(fù)的高倍視野,染色強度與陽性細(xì)胞百分比積分乘積的均值為每例切片的組化評分(LEPR expression score)。
1.2.2 基因芯片數(shù)據(jù)來源及分析 本課題組在前期實驗中已發(fā)表文章“Heterotypic CAF-tumor spheroids promote early peritoneal metastatis of ovarian cancer”并上傳5例HGSOC患者相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE73168(GPL570平臺[HG-U133 Plus 2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array),每例患者均配有原位病灶、腹水和轉(zhuǎn)移病灶標(biāo)本[9]。選擇Gene Symbol為LEPR的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
1.2.3 String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析可搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用,通過String數(shù)據(jù)庫預(yù)測LEPR蛋白的上下游調(diào)控蛋白及蛋白間的相關(guān)調(diào)控關(guān)系。檢索條件:(1)Protein Name:LEPR;(2)Organism:auto-detect。
1.2.4 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫基因相關(guān)性分析 通過基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析卵巢癌患者中LEPR與JAK、STAT3、Akt之間相關(guān)性。進(jìn)入網(wǎng)站后選擇Multiple Gene Analysis,Correlation Analysis,輸入LEPR與JAK2,LEPR與STAT3,LEPR與Akt1,Correlation Coefficient選擇Spearman,TCGA Tumor選擇OV Tumor。
2.1 肥胖HGSOC患者原位病灶和轉(zhuǎn)移病灶中LEPR表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,在HGSOC中LEPR以胞膜和胞漿表達(dá)為主(圖1)。10例肥胖HGSOC患者的配對標(biāo)本轉(zhuǎn)移病灶中,LEPR表達(dá)明顯強于原位病灶,組化評分的均數(shù)分別為11.60和7.60,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。
圖1 肥胖HGSOC患者原位病灶和轉(zhuǎn)移病灶中LEPR表達(dá)(IHC×200)
圖2 肥胖HGSOC患者原位病灶和轉(zhuǎn)移病灶中LEPR表達(dá)的免疫組化評分
2.2 基因芯片數(shù)據(jù)中LEPR表達(dá) 5例HGSOC配對原位病灶、腹水、轉(zhuǎn)移病灶的LEPR表達(dá)在組間呈下降趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.71)(圖3)。
圖3 基因芯片數(shù)據(jù)中不同標(biāo)本來源LEPR的表達(dá)(相對于原位病灶)
2.3 LEPR上下游關(guān)系預(yù)測 在String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫中,分析LEPR上下游關(guān)系,得到關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),相互作用節(jié)點數(shù)共有31個。LEPR參與細(xì)胞因子、脂肪代謝、胰島素抵抗和缺氧刺激的應(yīng)答通路(如JAK2、STAT3、INS),以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和分化、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、脂蛋白代謝和致癌轉(zhuǎn)化的通路(如MAPK、Akt、PTPN、AMPK)。
圖4 LEPR基因與上下游基因調(diào)控關(guān)系
2.4 LEPR與JAK2、STAT3、Akt1相關(guān)性分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析在卵巢癌中LEPR與JAK2、STAT3、Akt1的表達(dá)相關(guān)性,結(jié)果顯示LEPR與JAK2呈正相關(guān)(R=0.31,P<0.05),LEPR與STAT3呈正相關(guān)(R=0.33,P<0.05),LEPR與Akt1呈正相關(guān)(R=0.21,P<0.05)(圖5)。
圖5 卵巢癌中LEPR與JAK2、STAT3、Akt1相關(guān)性分析
有研究顯示,肥胖女性患卵巢癌的風(fēng)險更高,預(yù)后更差。Olsen等[9]通過綜合分析來自卵巢癌協(xié)會聯(lián)合會的15項病例對照研究,發(fā)現(xiàn)高BMI與I型卵巢癌的風(fēng)險增加相關(guān)。Protani等[4]對14項研究進(jìn)行了薈萃分析,結(jié)果顯示肥胖卵巢癌患者的存活率略低于非肥胖卵巢癌患者,且與肥胖出現(xiàn)的時間無關(guān)。Bae等[11]匯集了17項隊列研究,發(fā)現(xiàn)年輕時肥胖和(或)在卵巢癌確診前5年肥胖與較差的預(yù)后相關(guān)。肥胖的特征是慢性低度炎癥狀態(tài),與健康體重狀態(tài)相比,不同的細(xì)胞因子,包括瘦素,以較高的血清水平循環(huán)。原發(fā)性腫瘤中循環(huán)瘦素水平或LEPR的高表達(dá)與卵巢癌較差的預(yù)后相關(guān)[12-13]。
卵巢癌預(yù)后較差的原因主要在于卵巢癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。在復(fù)發(fā)方面,肥胖患者體內(nèi)高水平的瘦素,以及可能高水平的其他細(xì)胞因子(如IL-6),可能有助于術(shù)后仍處于休眠狀態(tài)的癌細(xì)胞(如腹水或腹腔中的漂浮細(xì)胞)存活,并促進(jìn)它們種植于新的位置(如脂肪組織或腹膜間皮),因此肥胖卵巢癌患者易于復(fù)發(fā)[14-15]。在轉(zhuǎn)移方面,本研究發(fā)現(xiàn),與原發(fā)病灶相比,LEPR在轉(zhuǎn)移病灶中的表達(dá)顯著升高。通過生物信息學(xué)分析,推測LEPR可能通過介導(dǎo)JAK/STAT3和PI3/Akt的活化,增加卵巢癌細(xì)胞的遷移與侵襲,促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移。JAK、STAT3、MAPK和Akt在其他上皮性癌癥中已被證實直接參與瘦素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[5-7]。
本研究得出的結(jié)論沒有在5例HGSOC患者的基因芯片數(shù)據(jù)中被證實,其結(jié)果顯示原位病灶、腹水、轉(zhuǎn)移病灶的LEPR表達(dá)在組間呈下降趨勢,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。原因可能是:(1)樣本量少;(2)患者的納入標(biāo)準(zhǔn)中沒有BMI限制,患者的瘦素與LEPR表達(dá)水平均較低。目前,本課題組正在招募新的HGSOC患者,納入標(biāo)準(zhǔn)限制BMI≥25kg/m2,并收集匹配的原發(fā)病灶、腹水和轉(zhuǎn)移病灶樣本,以進(jìn)一步證實本研究結(jié)果。
綜上所述,在肥胖HGSOC患者體內(nèi),LEPR可能通過JAK/STAT3和PI3/Akt通路,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。LEPR可能成為肥胖HGSOC患者治療和評估預(yù)后的潛在靶點和標(biāo)記物。