趙世云，袁立薇，曹 佳，張慧星，元娟娟，胡明月，黃婭妮，劉 丹

(1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院北京國家生物芯片研究中心寧夏分中心，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院婦科，銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學生育力保持重點實驗室，銀川 750004)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是由創(chuàng)傷、感染等因素引起子宮內膜基底層受損、子宮內膜修復障礙，病理結局為子宮內膜纖維化及瘢痕化的婦科疾病[1]。目前在子宮內膜修復微環(huán)境的研究中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是公認的最主要的促纖維化形成因子[2]。TGF-β1高表達導致子宮內膜修復障礙，是IUA病理性纖維化形成的重要環(huán)節(jié)[3]。Wnt/β-catenin信號通路在調控細胞增殖分化、維持組織穩(wěn)態(tài)等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用，Wnt/β-catenin信號通路與子宮內膜增殖及生理調節(jié)密切相關[4]。該通路中重要調控蛋白的異常表達與多種器官纖維化密切相關[5]。目前，越來越多的研究表明Wnt/β-catenin信號通路與TGF-β/Smad信號通路間存在交互調節(jié)，這種調節(jié)機制存在于配體水平，胞漿水平及細胞核中轉錄因子的相互作用中。以往關于Wnt/β-catenin與TGF-β/Smad的串擾主要集中于細胞分化、皮膚、肝等組織器官纖維化領域[6]。兩條通路在子宮內膜纖維化中的交互作用，目前尚不清楚。本實驗以人子宮內膜基質細胞(human endometrial stromal cells，hESCs)作為研究對象，通過TGF-β1誘導使其發(fā)生纖維化，構建IUA細胞模型，在此基礎上，驗證Wnt3a聯合TGF-β1促進IUA的發(fā)生，旨在探討Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信號通路在IUA發(fā)病過程中的交互作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2020年1月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院宮腔鏡中心，主因男方因素不孕的育齡健康婦女。于月經干凈3～7天行宮腔鏡檢查時收取子宮內膜組織，離體1h內無菌條件下進行原代分離培養(yǎng)?；颊呔炇鹬橥鈺?，并通過醫(yī)院倫理委員會審查。納入標準：年齡<40歲育齡期婦女；月經規(guī)律；子宮內膜無病理性改變；宮腔鏡下觀察內膜腺管形態(tài)符合增生期改變。排除標準：合并宮內其他異常；其他原因的不孕；合并其他內科疾病。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司；ECL化學發(fā)光液購自美國Millipore公司；Wnt3a蛋白購自美國Biovision公司；TGF-β1蛋白購自美國PeproTech公司；熒光定量PCR儀購自美國OLYMPUS公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；蛋白凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原代培養(yǎng)hESCs 將收集的子宮內膜組織標本放入含青鏈霉素的PBS溶液中，于超凈工作臺充分剪碎組織呈糜狀，將其放置于15mL離心管。加PBS溶液充分沖洗，室溫靜置,待組織塊完全沉至管底，棄PBS，加3.0mg/mL Ⅳ型膠原酶6mL，置37℃培養(yǎng)箱中消化20min。待組織塊呈拉絲狀后加等體積Accumax消化液，繼續(xù)消化15min，用移液槍吹打后400目尼龍篩網過濾，收集細胞懸液，1500r/min離心5min，DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。次日觀察細胞形態(tài)，待細胞密度達到80%～90%進行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 熒光定量PCR(RT-PCR) 用TRizol進行hESCs總RNA的提取，紫外分光光度儀測定RNA純度及濃度，利用逆轉錄試劑盒(日本，Takara)按產品說明書合成cDNA。PCR反應液按TB Green 10μL、Primer pair 0.8μL、cDNA 2μL、ddH2O 6.4μL體系進行配制。反應條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)，擴增結束后通過查看熔解曲線和擴增曲線確定結果的準確性。分析結果以β-actin作為內參，利用2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。引物序列均在PrimerBank查閱獲得，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.3 Western blot 收集hESCs，加RIPA蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測法測定蛋白質濃度，分別將待測樣品與5×loading buffer蛋白上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸5min促使蛋白變性。將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠孔內，放入電泳槽進行電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。加兔抗人單克隆抗體(α-SMA、CollageⅠ、Fibronectin、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1、MMP-9)溶液4℃孵育過夜。次日回收抗體，1×TBST溶液洗膜3次/10min，加抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育1h，1×TBST溶液洗膜3次/10min。采用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影后膠片曝光，使用Image J軟件根據內參GAPDH灰度值計算蛋白的相對表達。

1.3.4 細胞免疫熒光染色 消化hESCs為單細胞懸液，將其接種至鋪有蓋玻片的12孔板中進行培養(yǎng)，鏡下觀察匯合成單細胞層后進行免疫熒光染色：棄培養(yǎng)基，PBS清洗后加4%多聚甲醛溶液固定30min，PBS清洗后加0.5% Trixon X-100溶液破膜處理15min。加5% BSA封閉液室溫封閉1h，去除非特異性背景染色。PBS清洗后4℃避光搖床孵育一抗(Vimentin，abcam，ab92547)過夜，次日室溫繼續(xù)孵育1h。棄一抗，PBS清洗，加抗兔Alexa Fluor熒光二抗(Invitrogen，A21207)，室溫避光孵育2h，促使抗原抗體特異性結合。加提前配置的DAPI工作液(Solarbio，C0060)，室溫避光孵育20min促使細胞核著色。染色結束后，滴加抗熒光衰減淬滅劑(Solarbio，S2100)防止熒光淬滅。在熒光顯微鏡下觀察細胞的染色情況。

2 結 果

2.1 hESCs培養(yǎng)及鑒定 普通倒置光學顯微鏡觀察可見，細胞呈多角形或梭形，逐漸延伸成漩渦狀平行排列(圖1A)；免疫熒光染色結果顯示，基質細胞特異波形蛋白(Vimentin)染色呈陽性。表明分離獲取的細胞為hESCs(圖1B)。

圖1 普通倒置光學顯微鏡觀察和免疫熒光染色結果

2.2 不同濃度TGF-β1作用hESCs誘導纖維化的表達 RT-PCR和Western blot法結果顯示，與正常對照組(Control)相比，不同濃度(5ng/mL、10ng/mL)TGF-β1作用hESCs 24h后，Collage Ⅰ、Collage Ⅳ、α-SMA、Fibronectin mRNA及蛋白表達均升高，其中10ng/mL TGF-β1誘導作用更顯著。表明TGF-β1誘導hESCs發(fā)生纖維化，成功建構IUA細胞模型(圖2)。

圖2 纖維化標記物mRNA和蛋白的相對表達

2.3 不同濃度TGF-β1作用Wnt/β-catenin信號通路配體及核心分子表達 RT-PCR和Western blot法結果顯示，與對照組相比，TGF-β1誘導組Wnt/β-catenin信號通路核心分子(Axin2、β-catenin、GSK-3β、CyclinD1、MMP-9)mRNA和蛋白表達均升高；同法檢測配體(Wnt1、Wnt4、Wnt5b、Wnt3a、Wnt7a、Wnt9a)mRNA表達也升高，其中Wnt3a升高最顯著。Western blot法檢測TGF-β1誘導組Wnt3a蛋白表達，與RT-PCR結果一致。表明TGF-β1通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導hESCs纖維化的發(fā)生(圖3)。

圖3 Wnt信號通路配體及核心分子mRNA和蛋白的表達

2.4 Wnt3a聯合TGF-β1檢測纖維化及Wnt/β-catenin信號通路的表達 Wnt3a(100ng/mL)和TGF-β1(10ng/mL)聯合作用hESCs 24h，RT-PCR及Western blot法結果顯示，與Control組相比，Wnt3a組、TGF-β1組、Wnt3a與TGF-β1聯合組Collage Ⅰ、CTGF、Collage Ⅳ、α-SMA mRNA和蛋白表達均升高，組間比較，聯合組升高更明顯(P<0.05)(圖4)。同法檢測Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、GSK-3β、MMP-9、CyclinD1、C-myc的表達，結果顯示：Wnt3a與TGF-β1聯合作用上述分子mRNA和蛋白表達升高更顯著(圖5)。證實Wnt3a聯合TGF-β1通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進hESCs纖維化。

圖4 Wnt3a聯合TGF-β1作用纖維化標記物mRNA和蛋白相對表達

圖5 Wnt3a聯合TGF-β1作用Wnt信號通路核心分子的表達

3 討 論

纖維化是IUA的主要發(fā)病機制，纖維化的發(fā)生可能與體內部分促進創(chuàng)面修復或抑制組織纖維化的細胞因子的異常表達相關[7]。因此，探究參與IUA病理過程的細胞因子以及微環(huán)境機制對于其治療和預防至關重要。

TGF-β1是TGF-β家族中研究最廣泛的因子，研究表明，其在纖維化過程中起著至關重要的作用。文獻報道[7-8]，TGF-β1表達于IUA患者的子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞中，且其含量明顯高于非IUA患者[9]。單鐵英等[10]研究發(fā)現，TGF-β1可促使子宮內膜上皮細胞轉化為肌成纖維細胞,促進子宮內膜纖維化的進程。本研究結果顯示，在體外TGF-β1可促使hESCs合成α-SMA、Collage Ⅰ、Collage Ⅳ和Fibronectin顯著增加，表明TGF-β1能刺激hESCs轉分化為肌成纖維細胞,致膠原合成增加和細胞外基質沉積，與上述文獻的研究結果一致。由此可知，TGF-β1可促進hESCs轉化為肌成纖維細胞,促進子宮內膜纖維化的進程，促使組織纖維瘢痕形成[11]。

IUA發(fā)生的根本原因是子宮內膜增殖和修復障礙，Wnt/β-catenin信號通路在子宮內膜生理性調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用，雌激素通過激活經典Wnt信號通路促進內膜細胞的增殖和再生[12]。Wnt3a是Wnt基因家族中的重要成員[13]，Wnt3a能激活經典的Wnt/-catenin信號通路，促進β-catenin的積聚[14]。本研究中，Wnt3a誘導hESCs后，CollageⅠ、α-SMA、CTGF表達明顯升高。表明Wnt3a對子宮內膜纖維化有重要的促進作用，推測子宮內膜纖維化的形成可能與Wnt3a的異常表達激活Wnt/β-catenin信號通路密切相關。

最新研究結果提示，Wnt/β-catenin信號與一些參與纖維化的信號通路之間存在串擾(crosstalk)，其中研究較多的是與TGF-β/Smad信號之間的交互調節(jié)，在纖維化進程中，以上兩條通路存在交互作用。Caraci等[15]認為，TGF-β1可通過ERK途徑激活β-catenin，進而促進肺成纖維細胞的表型轉化。Zhou等和Charbonney等[16-17]分別發(fā)現，TGF-β可能與β-catenin共同參與了上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)這一纖維化疾病發(fā)生的過程。本研究中不同濃度TGF-β1作用正常hESCs后，CollageⅠ、α-SMA、CTGF及Wnt/β-catenin信號通路Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、CyclinD1、MMP-9水平高表達，表明在體外實驗中，TGF-β1可通過激活Wnt/β-catein途徑來促使hESCs纖維化的發(fā)生。同時發(fā)現，Wnt3a聯合TGF-β1進一步促進Wnt/β-catenin信號通路核心分子及下游靶基因表達升高。以上結果進一步證實，Wnt3a和TGF-β1協同激活Wnt/β-catenin通路促進hESCs纖維化。

綜上所述，在hESCs纖維化中Wnt3a、TGF-β1高表達可能與宮腔粘連的發(fā)生密切相關，Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad兩條信號通路可能協同參與子宮內膜纖維化及促進IUA的形成。而這兩個指標如何相互促進IUA發(fā)生發(fā)展仍有待進一步研究。因此，需進一步實驗探索TGF-β/Smad信號和Wnt/β-catenin信號通路中各介質與IUA的關系。抑制Wnt3a表達或阻斷兩條通路的活化可能成為干預IUA的突破點。