蔡 偉 ，李 敏 ，施亞寧 ，李兆慧 ，陳夢(mèng)婷 ，何 欣 ，羅益遠(yuǎn) *

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥學(xué)院，寧波315100；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林132101）

廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分[1]，傳統(tǒng)的中藥材，別名又為落地金錢、銅錢草、馬蹄香。在采集廣金錢草時(shí)通常在夏季和秋季采割其干燥的部分， 除去其本身的雜質(zhì)，并曬干。大多分布在我國(guó)的福建省、廣西省、湖南省等地。 具有甘、淡、涼的性味,并具有清熱利濕、通淋排石的功效[2-6]。

廣金錢草中黃酮類化合物的提取方法有超濾法、熱回流法、超聲波提取法、水提法、微波提取法等。纖維素酶在現(xiàn)實(shí)生活中有著很廣泛的運(yùn)用， 是一種輔助作用性能很強(qiáng)的水解纖維素復(fù)合酶， 使用水酶法可以降低消耗、并且能夠減少化學(xué)試劑的用量，使得實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境溫和的優(yōu)點(diǎn)， 已廣泛運(yùn)用于中草藥主要成分的提取研究中[7-10]。 本次試驗(yàn)是通過(guò)超聲波提取法，又以纖維素酶來(lái)進(jìn)行輔助，本試驗(yàn)以廣金錢草為原料，采用纖維素酶協(xié)同超聲波提取法進(jìn)行變量對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)廣金錢草中總黃酮的提取工藝進(jìn)行篩選。 旨在為廣金錢草藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考，為廣金錢草的進(jìn)一步研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

ALC-310.3 型電子分析天平 （奧豪斯儀器有限公司）；742W 型紫外可見分光光度計(jì) （上海奧譜勒儀器有限公司）；KQ-700v 型超聲波清洗器（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）；80-11 型離心機(jī) （長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；蘆?。ㄅ?hào)：0080-9705，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）、纖維素酶（≥50U/mg）、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇等（以上試劑均為分析純）。

試驗(yàn)廣金錢草藥材樣品為2019 年實(shí)地采集，藥材采集后凈制干燥，即的。所有樣品均鑒定為豆科植物廣金錢草 Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。 留樣保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至容量瓶中， 用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液配制0.020mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 5 個(gè) 10mL 容量瓶， 加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL， 分別加入50%無(wú)水乙醇使各溶液都是5mL，各加入 0.3mL5%Na2NO2溶液，搖勻靜置 5min 后加10%Al (NO3)3溶液 0.3mL， 搖勻靜置 5min 后再加2mL4%NaOH 溶液，搖勻，最后用50%無(wú)水乙醇定容，靜置15min。 以對(duì)應(yīng)試劑為空白，對(duì)不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在510nm 下掃描測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，以濃度C 為橫坐標(biāo)，吸光度A 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為：Y=8.6116X+0.0007 相關(guān)系數(shù) R2=0.9997。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取工藝流程

超聲波輔助法提取廣金錢草中黃酮總含量的工藝流程： 廣金錢草葉粉末→加入適量纖維素酶→破壁水解→煮沸，使酶滅活→乙醇浸提，超聲波處理→離心→收集上清液→定容→待測(cè)。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同料液比對(duì)廣金錢草總黃酮含量影響

準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉5 份，加入750mg 纖維素酶，在40℃的條件下酶解15min。反應(yīng)后將其煮沸5min，使酶滅活，靜置。 料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 等 5 個(gè)水平進(jìn)行提取， 乙醇濃度為 50%，超聲波提取50min，離心取上清液，定容至刻度待測(cè)，測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖2。 不同料液比情況下提取廣金錢草中黃酮總含量試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1。

圖2 料液比對(duì)廣金錢草中提取黃酮總含量的影響

表1 料液比的單因素方差分析

由上表 1 可知，F(xiàn)=47.804，P＜0.05 且 P＜0.01， 因此可以認(rèn)為5 種不同料液比對(duì)提取廣金錢草中黃酮總含量差異極顯著。 對(duì)其做多重比較，結(jié)果見表2。 由上表2 可知當(dāng) α=0.01 時(shí)， 料液比 1∶40、1∶50、1∶10 之間均無(wú)顯著性差異。 料液比1∶20 與其他各水平之間均有顯著性差異。 料液比1∶30 與其他各水平均有顯著性差異，在料液比達(dá)到1∶30 的情況下總黃酮含量達(dá)到峰值。 為了進(jìn)一步考察料液比對(duì)黃酮總含量提取的效果的影響，選擇料液比 1∶20、1∶30、1∶40 作為正交試驗(yàn)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 料液比的多重比較

2.3.2 酶解溫度對(duì)廣金錢草總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉5 份，加入750mg 纖維素酶，酶解溫度設(shè)置在 30、35、40、45、50℃的條件下酶解15min。反應(yīng)后將其煮沸5min，使酶滅活。在料液比為 1∶30，50%乙醇，超聲波提取 50min，離心，取上清液定容，測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖3。 不同酶解溫度情況下提取廣金錢草中黃酮總含量試驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析見表3，結(jié)果顯示P＞0.05，因此該因素分析無(wú)意義。

圖3 酶解溫度對(duì)廣金錢草提取黃酮總含量的影響

表3 酶解溫度的單因素方差分析

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)廣金錢草總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉5 份，加入750mg 纖維素酶，在40℃的條件下酶解15min。反應(yīng)后將酶液煮沸 5min，使酶滅活，靜置。料液比為 1∶30，50%乙醇濃度為， 超聲時(shí)間分別在 10、30、50、70、90min 的條件下進(jìn)行上述試驗(yàn)，然后離心，取上清液定容，測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖4。 不同超聲波時(shí)間情況下提取廣金錢草中黃酮總含量試驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析見表4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)廣金錢草黃酮總含量的影響

表4 超聲波提取時(shí)間的單因素方差分析

由表 4 可知，F(xiàn)=31.484， 其顯著值 P＜0.05 且 P＜0.01,因此可以認(rèn)為5 種不同超聲波提取時(shí)間對(duì)提取廣金錢草中黃酮總含量差異極顯著。再對(duì)其做多重比較，結(jié)果見表5。 當(dāng)超聲波時(shí)間為90 和10min 時(shí)，二者之間均無(wú)顯著性差異，超聲波時(shí)間為10 和30min 時(shí)差異較顯著，超聲波時(shí)間為30 和70min 時(shí)，二者之間均無(wú)顯著性差異， 超聲波時(shí)間為50min 時(shí)與其他各水平之間均有顯著性差異， 此時(shí)黃酮總含量達(dá)到峰值， 選擇30、50、70min 作為正交試驗(yàn)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表5 超聲波提取時(shí)間的多重比較

2.3.4 乙醇濃度對(duì)廣金錢草總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉5 份，加入750mg 纖維素酶，在40℃的條件下酶解15min。反應(yīng)后將酶液煮沸 5min，使酶滅活，靜置。 料液比為 1∶30，乙醇濃度分別為為 30%，40%，50%，60%，70%， 超聲提取 50min，然后離心，取上清液定容，測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖5。 不同乙醇濃度情況下提取廣金錢草中黃酮總含量試驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析見表6。

圖5 乙醇濃度對(duì)廣金錢草黃酮總含量的影響

表6 乙醇濃度的單因素方差分析

由表 6 可知，F(xiàn)=22.845， 其顯著值 P＜0.05 且 P＜0.01,因此可以認(rèn)為5 種不同乙醇濃度對(duì)提取廣金錢草中黃酮總含量差異極顯著。再對(duì)其做多重比較，結(jié)果見表 7。 由上圖可知當(dāng) α=0.05 和當(dāng) α=0.01 時(shí)，乙醇濃度為40%、70%和60%時(shí)此三個(gè)水平之間均無(wú)顯著性差異， 且與其他水平之間有顯著性差異， 乙醇濃度為30%和乙醇濃度為50%時(shí)兩個(gè)水平之間存在顯著差異。 在乙醇濃度為50%的情況下黃酮總含量達(dá)到峰值， 因此選擇乙醇濃度為40%、50%、60%的兩個(gè)水平作為正交試驗(yàn)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表7 乙醇濃度的多重比較

2.3.5 纖維素酶含量對(duì)廣金錢草總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉5 份， 選用纖維素酶分別為 250、500、750、1000、1250mg，在 40℃的條件下酶解15min。反應(yīng)后將酶液煮沸5min，使酶滅活，靜置。料液比為1∶30，50%乙醇，超聲提取50min，取上清液定容，測(cè)定吸光度，結(jié)果見圖6。 不同纖維素加酶量情況下提取廣金錢草中黃酮總含量試驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析見表8。

圖6 加酶量對(duì)廣金錢草黃酮總含量的影響

表8 加酶量的單因素方差分析

結(jié)果顯示，F(xiàn)=5.292，其顯著值P＜0.05,因此可以認(rèn)為5 種不同纖維素酶含量對(duì)提取廣金錢草中黃酮總含量差異顯著。 再對(duì)其做多重比較見表9，當(dāng)纖維素酶含量為250、500 和1250mg 時(shí)， 三者之間均無(wú)顯著性差異，纖維酶含量為500、1250 和1000mg 時(shí)三者之間均無(wú)顯著性差異， 纖維素酶含量為1000 和750mg 時(shí)互相無(wú)顯著差異。 選擇其及其最近兩段水平即纖維素酶含量為 500、750、1000mg 時(shí)作為正交試驗(yàn)水平， 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表9 加酶量的多重比較

2.4 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選以纖維素酶、乙醇濃度、超聲波時(shí)間和料液比4 個(gè)因素為主要考察因素。 通過(guò)L9（34）的正交設(shè)計(jì)，以黃酮總含量為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，取9 份廣金錢草粉末，按照因素水平表（表10）的設(shè)計(jì)條件進(jìn)行試驗(yàn)。 正交試驗(yàn)結(jié)果見表11。

表10 廣金錢草水提工藝因素水平表

表11 正交試驗(yàn)表及試驗(yàn)結(jié)果

以黃酮總含量為指標(biāo)，極差R 分析表明，四個(gè)因素影響廣金錢草中提取黃酮總含量的主次關(guān)系依次是乙醇濃度（C）＞料液比（A）＞纖維素酶（B）＞超聲波提取時(shí)間（D）。 正交試驗(yàn)結(jié)果推定C2A2B1D1為最佳提取條件，即乙醇濃度 50%、料液比 1∶30，纖維素酶 500mg，超聲波提取時(shí)間30min。

2.5 優(yōu)化工藝的重現(xiàn)性試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證工藝的穩(wěn)定， 準(zhǔn)確稱量10g 廣金錢草粗粉，加入濃度50%乙醇、料液比1∶30，纖維素酶500mg，超聲波提取時(shí)間30min。重復(fù)試驗(yàn)3 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證最佳的提取工藝，結(jié)果見表12。 結(jié)果表明，3 次試驗(yàn)中總黃酮含量平均為2.28%，RSD 值為0.95%。 驗(yàn)證結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

本試驗(yàn)以廣金錢草為原料， 采用纖維素酶協(xié)同超聲波提取法進(jìn)行變量對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)廣金錢草中總黃酮的提取工藝進(jìn)行篩選。 所得工藝合理，抗氧化活性較高，為魚腥草的進(jìn)一步研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。