王文婷 ，王彥珺 ，林向輝 ，林曉熙 ，李 偉 ，任 珅 *

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.遼寧熙峰藥業(yè)集團(tuán)有限公司，桓仁117000）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌在世界上作為一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤， 已成為全球第三大與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因[1]。 肝癌治療的選擇取決于腫瘤的生物學(xué)行為，目前臨床上治療肝癌的方法眾多，主要包括化學(xué)治療、放療和手術(shù)切除等[2]。近年來(lái)，大量科學(xué)研究表明，由天然產(chǎn)物衍生的藥物具有高效、低毒的功效，因此被廣泛應(yīng)用于抗癌藥物的使用[3]。

人參為五加科人參屬Panax ginseng C.A. Meyer植物的干燥根及根莖， 是我國(guó)一種集藥用和營(yíng)養(yǎng)雙重價(jià)值的傳統(tǒng)中草藥，享有“中華神草”“百草之王”等美譽(yù)，具有大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)脾益肺等功效，久服可輕身延年、增強(qiáng)免疫功能[4-5]。近年來(lái)，人參的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到人們廣泛關(guān)注，因此人參系列產(chǎn)品也隨之產(chǎn)生，例如人參糖果、人參飲料等。 同時(shí)，通過(guò)利用人參精深加工得到的產(chǎn)品，來(lái)進(jìn)一步提升人參的功效，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，更符合現(xiàn)代“以食為養(yǎng)、以食為療”的養(yǎng)生理念[6]。因此，開(kāi)發(fā)人參功能性食品對(duì)于促進(jìn)人參相關(guān)制品的深度開(kāi)發(fā)具有顯著的現(xiàn)實(shí)意義。

鮮人參膏（Fresh ginseng paste,FGP）是在原膏劑基礎(chǔ)上引入的一種創(chuàng)新性的制備工藝，主要充分利用專利技術(shù)[7]，選用新鮮人參并利用其不同部位的加工方法，配以紅棗精華，科學(xué)加工，轉(zhuǎn)化稀有活性物質(zhì)，成功富集出以 Rk1，Rg5，Rg3 為代表的 16 種稀有皂苷組分群，最大限度地保留了人參中所有活性成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6,8]，同時(shí)更富含精氨酸雙糖苷AFG、氨基酸、多糖、人參蛋白等多種有益物質(zhì)[9]。

人參加工產(chǎn)品因其富含人參皂苷并具有豐富的藥理活性，是一種獨(dú)特的藥食兼具的開(kāi)發(fā)品。本文以人參的現(xiàn)代研究背景， 初步探究人參新型加工品 “鮮人參膏”對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，以期為人參功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)， 進(jìn)一步豐富人參系列深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 ICR 小鼠，SPF 級(jí)，5～6 周齡，體重 20～22g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（吉）2018-0007，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后隨機(jī)分成4 組，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料、試劑與儀器

小鼠H22肝癌細(xì)胞株， 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室傳代并保存；注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司；鮮人參膏（FGP），五星級(jí)產(chǎn)品，遼寧熙峰藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供（SC10721052200667）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）試劑盒，購(gòu)自美國(guó) R&D 公司。

VD-650 超凈工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；酶標(biāo)儀Spectra Max Plus 384， 美國(guó)分子生物儀器公司；Neofuge 1600R 高速離心機(jī)， 上海力新儀器有限公司；Leica DM 500 顯微鏡， 德國(guó)徠卡有限公司；AL 104 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 藥物配制

準(zhǔn)確稱取鮮人參膏適量，加CMC-Na 混懸至所需給藥濃度，按10 mL/kg 灌胃給藥。 準(zhǔn)確稱取環(huán)磷酰胺（CTX）適量，用生理鹽水配制成所需濃度，采用腹腔注射給藥形式。

1.4 移植瘤動(dòng)物模型建立

將腹水型小鼠腫瘤H22細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，用含10%FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。取最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的小鼠腫瘤H22細(xì)胞，濃度調(diào)為5×106/mL，以 0.2 mL/只(1 ×106 個(gè)細(xì)胞/只)無(wú)菌注入雄性ICR 小鼠腹腔內(nèi)，進(jìn)行接種傳代，于接種7d 左右，小鼠腹部膨隆，出現(xiàn)血性腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接種。 于無(wú)菌條件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，用無(wú)菌生理鹽水稀釋后，1500 r/min 離心10 min， 洗滌細(xì)胞3次，取0.2 mL 瘤細(xì)胞懸液接種到雄性ICR 小鼠的右肩皮下。

1.5 動(dòng)物分組與給藥處理

ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，接種后第2d，小鼠隨機(jī)分成共 4 組，即模型組（Model），陽(yáng)性對(duì)照組（CTX,30 mg/kg），F(xiàn)GP 低劑量組（FGP-L, 300 mg/kg）和高劑量（FGP-H, 600 mg/kg）組，每組 10 只。 CTX 采用腹腔注射方式給藥，F(xiàn)GP 組采用灌胃給藥，模型組以等量的生理鹽水代替，每日1 次，連續(xù)15d。 末次給藥后禁食不禁水，16 h 后眼球取血斷頸處死，收集血液及組織做相關(guān)分析。

1.6 抑瘤率和免疫器官指數(shù)測(cè)定

分別稱取小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。 并稱取脾臟、胸腺質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。 眼球取血后頸椎脫臼處死，完整剝離瘤塊，分離血清。

抑瘤率＝（模型組瘤質(zhì)量－藥物組瘤質(zhì)量）/模型組瘤質(zhì)量

胸腺（肝臟、脾臟）指數(shù)＝胸腺（肝臟、脾臟）質(zhì)量／體質(zhì)量

1.7 轉(zhuǎn)氨酶與細(xì)胞因子測(cè)定

依照南京建成生物工程有限公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)， 采用微板法檢測(cè)血清中肝功能指標(biāo)， 包括ALT和AST。 依照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將小鼠血清稀釋后，分別采用 TNF-α 和 IFN-γ 的 ELISA 試劑盒利用雙抗體夾心法測(cè)定血清中二者含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)t 檢驗(yàn)或利用SPSS 19.0 軟件ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 各項(xiàng)數(shù)據(jù)以 Mean ±SD 表示， 用 GraphPad Prism 8.0.4 軟件進(jìn)行方差分析并繪圖。 P＜0.05 或P＜0.01 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明：模型組小鼠狀態(tài)萎靡，毛色暗淡，F(xiàn)GP給藥組小鼠狀態(tài)改善明顯， 較為活潑。 由表1 可知，CTX 組及FGP 低、高劑量組的平均瘤質(zhì)量均顯著低于模型組（P＜0.05），且 FGP 低、高劑量組的平均瘤質(zhì)量顯著高于 CTX 組（P＜0.05）；腫瘤抑制率以 CTX 組達(dá)到最高，為60.18%，F(xiàn)GP 高、低劑量組次之。

表1 FGP 對(duì)H22 移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 （n=10,Mean±S.D)Table 1 The effect of FGP on tumor growth of H22 transplanted tumor mice(n=10,Mean±S.D)

2.2 對(duì)H22 荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

結(jié)果表明：如表2 所示，與模型組相比，CTX 組胸腺指數(shù)顯著下降 （P＜0.05），F(xiàn)GP 低、 高劑量組與 CTX組相比顯著升高（P＜0.05）。 CTX 組的脾臟指數(shù)明顯低于模型組 （P＜0.05）， 隨著 FGP 給藥劑量的增加，與CTX 組相比，脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。

表2.FGP 對(duì)H22 移植瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10,Mean±S.D)Table 2.The effect of FGP on immune organ index of H22 transplanted tumor mice(n=10,Mean± S.D)

2.3 對(duì)H22 荷瘤小鼠肝功能的影響

如圖1 所示， 與模型組比較，CTX 組小鼠血清中ALT 和 AST 的水平顯著升高 （P＜0.05）， 與 CTX 組相比，F(xiàn)GP 低、 高劑量組能夠明顯抑制血清中 ALT 和AST 水平的升高（P＜0.05），初步證明了 FGP 對(duì) H22荷瘤小鼠肝功能具有一定的保護(hù)作用。

圖1 FGP 對(duì)H22 荷瘤小鼠肝功能ALT 和AST 的影響（n=10,Mean±S.D）Fig.1 The effect of FGP on ALT and AST of liver function in H22 tumor-bearing mice e(n=10,Mean ±S.D)

2.4 對(duì)H22 荷瘤小鼠相關(guān)細(xì)胞因子的影響

由圖2 所示， 與模型組相比，CTX 組小鼠血清中TNF-α 和 IFN-γ 含量明顯增高，差異顯著（P＜0.05）；與CTX 組相比，F(xiàn)GP 低、 高劑量組小鼠血清中TNF-α水平顯著升高；小鼠血清中IFN-γ 水平隨著FGP 給藥劑量的增加也隨之增加，其中FGP 高劑量組與模型組相比顯著升高。

圖 2.FGP 對(duì) H22 荷瘤小鼠細(xì)胞因子 TNF-α 和 IFN-γ 水平的影響（n=10,Mean ± S.D）Fig.2.The effect of FGP on the levels of cytokines TNF-α and IFN-γ in H22 tumor-bearing mice(n=10,Mean ± S.D)

3 討論

近年來(lái)， 原發(fā)性肝細(xì)胞癌的病死率已居我國(guó)惡性腫瘤中的第二位[10]，因此引起人們的廣泛關(guān)注，該研究結(jié)果表明，F(xiàn)GP 能夠有效抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)其腫瘤抑制率，具有一定的抗腫瘤作用。 當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，其臟器質(zhì)量和指數(shù)發(fā)生改變。在本研究中，隨著FGP 給藥劑量的增加，脾臟指數(shù)明顯下降，且與CTX 組相比具有顯著性；FGP 低、 高劑量組與CTX組差異顯著，說(shuō)明FGP 可以有效的對(duì)荷瘤小鼠的免疫臟器發(fā)揮保護(hù)作用。

血清中ALT 和AST 水平是反應(yīng)肝功能的兩個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體肝功能受到損傷時(shí)，兩者水平會(huì)顯著升高[11]。 本研究通過(guò)建立H22皮下移植瘤模型小鼠，并通過(guò)CTX 腹腔注射給藥及FGP 灌胃給藥的方式探討其抗腫瘤作用。 結(jié)果顯示，與模型組相比，CTX 組小鼠血清中的ALT 和AST 水平均顯著升高；與CTX 組相比，F(xiàn)GP 低、高劑量組小鼠血清中ALT 和AST 水平均有明顯的降低， 表明肝損傷的程度被明顯改善， 說(shuō)明FGP對(duì)H22荷瘤小鼠起到一定的抗腫瘤作用。

大量研究表明， 腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫功能下降及失調(diào)有關(guān)，CTX 作為臨床上常用的一種廣譜抗腫瘤藥物，主要通過(guò)免疫抑制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。 在治療過(guò)程中， 與模型組比較，CTX 組小鼠腫瘤平均質(zhì)量顯著下降，胸腺指數(shù)及其脾臟指數(shù)也顯著降低。脾臟是一種重要的機(jī)體免疫器官， 胸腺是T 淋巴細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生是，T 淋巴細(xì)胞會(huì)增殖分裂釋放出多種細(xì)胞因子， 細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)起到相互促進(jìn)或相互抑制的作用，從而來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，同時(shí)作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[13]。 TNF-α 是一種促炎因子， 能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞且對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的毒害作用的一種細(xì)胞因子[14]。 FGP 可以使小鼠血清中TNF-α 水平顯著上升，可能是通過(guò)增加血清中腫瘤壞死因子的含量從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤作用。IFN-γ 主要由活化的Th 細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)Th1 細(xì)胞發(fā)育并且抑制Th2 細(xì)胞活化與增殖，刺激B 細(xì)胞產(chǎn)生的抗體類型向調(diào)理素方向轉(zhuǎn)變， 具有抗病毒，抗腫瘤和免疫調(diào)控的作用[15]。FGP 可以使小鼠血清中IFN-γ 水平明顯升高，說(shuō)明FGP 是通過(guò)促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫因子增強(qiáng)其抗腫瘤作用。

綜上所述，F(xiàn)GP 對(duì)H22荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用，其抑制腫瘤作用可能與增強(qiáng)機(jī)體免疫力，保護(hù)機(jī)體肝功能受損及升高血清中TNF-α 和IFN-γ 水平有關(guān)。 此外，與CTX 組相比，F(xiàn)GP 的抗腫瘤作用較好，并且其毒性較低。 該研究闡述了FGP 對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用， 初步揭示了鮮人參膏能夠通過(guò)抑制腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到保護(hù)作用，具有預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用，為人參及相關(guān)產(chǎn)品的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。