熊建文　李俊琦　梁瑩　謝琳　孫松　蔡錦源　韋坤華

摘要：【目的】開展大葉千斤拔葉黃酮（Flemingia macrophylla leaf flavonoids，F(xiàn)MLF）的超聲—微波協(xié)同提取工藝及其抗氧化活性研究，為FMLF的進一步綜合開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎?！痉椒ā恳訤MLF得率為優(yōu)選指標，固定超聲波功率50 W，采用單因素試驗考察乙醇體積分數(shù)、液料比、浸泡時間、微波功率和提取時間對FMLF得率的影響，并采用正交設計表L16（45）優(yōu)選FMLF的超聲—微波協(xié)同提取工藝，同時測定FMLF清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O[-2]·）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和亞硝酸鹽的能力，以評價其體外抗氧化活性?！窘Y果】各因素影響超聲—微波協(xié)同提取FMLF效果的排序為：乙醇體積分數(shù)>微波功率>液料比>浸泡時間>提取時間，且乙醇體積分數(shù)、微波功率和液料比對FMLF提取效果有顯著影響（P<0.05）。優(yōu)選的FMLF提取條件為：乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1（mL/g）、浸泡時間8 min、微波功率400 W、提取時間180 s，在此工藝條件下FMLF得率可達60.25 mg/g，且超聲—微波協(xié)同提取效率優(yōu)于單獨超聲和單獨微波提取。在試驗范圍內(nèi)，F(xiàn)MLF對·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸鹽的清除作用與FMLF質(zhì)量濃度均存在明顯的量效關系，F(xiàn)MLF對·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸鹽的清除率最高分別達73.05%、73.82%、82.54%和93.04%，其半數(shù)清除濃度（IC50）分別為1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL。【結論】正交試驗優(yōu)化的超聲—微波協(xié)同提取法可用于FMLF的提取，F(xiàn)MLF具有一定的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑進行開發(fā)。

關鍵詞： 大葉千斤拔;黃酮;超聲—微波協(xié)同提取;抗氧化活性

中圖分類號： S184? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）01-0198-08

Abstract：【Objective】The ultrasonic-microwave collaborative extraction process of Flemingia macrophylla leaf flavonoids（FMLF） was investigated in this study. Meanwhile，the antioxidant activity of FMLF was studied to provide data basis for the further comprehensive development and utilization of FMLF. 【Method】FMLF yield as optimizing targets，fixing ultrasonic power as 50 W，the single factor experiment was adopted to investigate the influence of ethanol concentration，liquid-solid ratio，soaking time，microwave power and extraction time on FMLF yield. Orthogonal design table L16（45） was used to optimize ultrasonic-microwave collaborative extraction process of FMLF，and its ability to remove hydroxyl radical （·OH），superoxide anion radical（O[-2]·），1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·） and nitrite was measured， in order to evaluate its antioxidant activity in vitro. 【Result】The order of various factors affecting the ultrasonic-microwave synergistic extraction process was： ethanol concentration>microwave power>liquid-solid ratio>soaking time>extraction time，and ethanol volume fraction，microwave power and liquid-solid ratio had significant effects on the extraction effect of FMLF（P<0.05）. The optimized extraction condition of FMLF was as follows： ethanol concentration 60%，liquid-solid ratio 21∶1（mL/g），soaking time 8 min， microwave power 400 W，and extraction time 180 s. Under this process condition，the FMLF yield reached 60.25 mg/g，and the efficiency of ultrasonic-microwave collaborative extraction was better than that of the ultrasonic and microwave extraction alone. Within the scope of the experiment，the scavenging effect of FMLF for ·OH，O[-2]·，DPPH· and nitrite showed obvious concentration-response relationship with FMLF mass concentration. Clearance rates of FMLF for ·OH，O[-2]· and DPPH· and nitrite were 73.05%，73.82%，82.54% and 93.04%，respectively，and half scavenging concentration（IC50） were 1.42，2.88，0.66 and 1.24 mg/mL，respectively. 【Conclusion】The ultrasonic-microwave collaborative extraction method optimized by? orthogonal test can be used for the extraction of FMLF.? FMLF has certain antioxidant activity and can be used as a natural antioxidant.

Key words： Flemingia macrophylla; flavone; ultrasonic-microwave collaborative extraction; antioxidant activity

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2016GXNSFBA380025）; Guangxi University Teachers Basic Ability Improvement Project（2018KY0870，2019KY1107）; Scientific Research and Innovation Project of Lushan College， Guangxi University of Science and Technology（2018LSTD02）

0 引言

【研究意義】大葉千斤拔（Flemingia macrophylla）又名千斤力、千金紅、大豬尾、老鼠尾和白馬屎等，是豆科千斤拔屬植物，收錄于2015版《中國藥典》（梁瑩等，2017）。其根是我國西南少數(shù)民族常用的藥物（蔡錦源等，2016），具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，富含多種天然雌激素如染料木素和染料木苷等多種黃酮類化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和祛風活血等功效（Lai et al.，2013;Wang et al.，2017）。因此，進行大葉千斤拔黃酮的提取及其抗氧化活性研究，對大葉千斤拔的綜合利用具有重要意義。【前人研究進展】目前，提取千斤拔總黃酮的方法主要有水浸提法、乙醇回流提取法、微波輔助萃取法和超聲提取法等，提取效率較高、操作簡便。年曉莉等（2008）采用水浸提法對蔓性千斤拔總黃酮進行提取，最佳提取工藝為：料液比1∶30（g/mL，下同），于75 ℃條件下水提3 h，提取3次。任朝琴和劉圓（2009）采用乙醇回流提取法對千斤拔總黃酮進行提取，最佳工藝參數(shù)為：回流時間3 h、料液比1∶14、乙醇體積分數(shù)50%、提取2次。陳帥和王慧竹（2011）采用正交試驗優(yōu)化獲得超聲輔助提取千斤拔總黃酮的工藝條件為：乙醇體積分數(shù)80%、提取時間25 min、料液比1∶20、提取2次。陳鵬等（2012）采用星點設計—效應面法優(yōu)化千斤拔的回流提取工藝，最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)60%～80%、溶媒比24～26倍、提取時間180～240 min、提取2次。陳帥等（2013）采用正交試驗法優(yōu)化千斤拔總黃酮微波提取工藝，在最佳提取工藝條件（乙醇體積分數(shù)60%、微波功率500 W、微波時間60 min、料液比1∶15、微波溫度65 ℃）下，獲得千斤拔總黃酮提取率為1.146%。陳帥等（2015）采用微波輔助雙水相提取千斤拔總黃酮，在最佳工藝條件（乙醇體積分數(shù)41%、硫酸銨加入量0.28 g/mL、微波時間21 min、微波功率550 W）下，千斤拔總黃酮得率為6.64%。蔡錦源等（2016）采用均勻設計與正交設計聯(lián)用優(yōu)選大葉千斤拔的微波輔助提取工藝，得到最佳提取工藝條件：微波功率700 W、提取溫度80 ℃、解析劑水用量7∶1（mL/g）、微波時間120 s、液料比35∶1（mL/g，下同）、提取時間50 min。王巖等（2017）采用乙醇回流提取法對蔓性千斤拔總黃酮進行提取，并測定提取物對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和羥自由基（·OH）的抗氧化性能，結果表明，在提取時間20 min、料液比1∶4、乙醇體積分數(shù)80%、提取溫度80 ℃的條件下，獲得提取物的黃酮含量為0.92 mg/mL;提取物對DPPH·的清除率與抗壞血酸相當，對·OH具有一定的清除效果。李楠等（2019）采用乙醇加熱回流法提取蔓性千斤拔總黃酮，最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)90%、提取溫度100 ℃、提取時間60 min、提取2次?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關大葉千斤拔的研究主要集中在根部，其莖葉不作為藥用部位故研究較少，少數(shù)用于牲口飼料，絕大部分當作廢棄物被遺棄，有關大葉千斤拔葉黃酮（F. macrophylla leaf flavonoids，F(xiàn)MLF）的提取及其生物活性研究尚屬空白?！緮M解決的關鍵問題】通過單因素和正交試驗優(yōu)選FMLF的超聲—微波協(xié)同提取工藝條件，并對FMLF的體外抗氧化活性進行研究，以期為FMLF的進一步綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用大葉千斤拔葉子產(chǎn)自南寧，由廣西藥用植物園提供，經(jīng)韋坤華研究員鑒定為豆科植物大葉千斤拔的葉子;乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、醋酸鉀、氫氧化鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、雙氧水、DPPH、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸亞鐵和水楊酸等均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：UV2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）;JY1002（0.01 g）電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）;CW-2000型超聲—微波協(xié)同萃取儀（超聲波功率/頻率50 W/40 KHz，微波功率/頻率0～1000 W（任意可調(diào)）/2450 MHz），DZF-6090真空干燥箱（北京中科博達儀器科技有限公司）;HH-S21-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）;TDL-80-2B低速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 FMLF提取工藝 將新鮮采摘的大葉千斤拔葉子45 ℃真空干燥至恒重，粉碎后過60目篩備用。準確稱取粉末3 g放入圓底提取瓶中，按一定比例加入提取溶劑，靜止浸泡一定時間后進行超聲—微波協(xié)同提取，提取結束后過濾，所得濾液即為粗提物，用于測定黃酮含量及抗氧化活性。

1. 2. 2 FMLF含量測定 參考張林濤等（2011）的方法，采用紫外分光光度法測定。稱取試劑蘆丁0.010 g，用無水乙醇加熱溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制標準品溶液。取標準品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 mL分別置于試管中，用蒸餾水稀釋至5.0 mL，充分振蕩搖勻;分別取0.5 mL稀釋后不同質(zhì)量濃度標準溶液或稀釋后的樣品置于試管中，加0.1 mL 10%硝酸鋁，充分振蕩搖勻;再加入0.1 mL 1 mol/L醋酸鉀，充分振蕩搖勻后加入3.0 mL 80%乙醇，充分振蕩搖勻，避光靜置40 min;顯色后在紫外可見分光光度計415 nm處測其吸光值，做3組平行，取平均值。以蘆丁質(zhì)量濃度作橫坐標、吸光值作縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。根據(jù)黃酮標準回歸方程及公式（1）和公式（2）計算黃酮得率：

W=T×V×C/103? （1）

X=W/M? （2）

式中，W為黃酮含量（mg），T為提取液的稀釋倍數(shù)，V為提取液體積（mL），C為由標準曲線計算得的質(zhì)量濃度（?g/mL），X為FMLF得率（mg/g），M為樣品投料量（g）。

1. 2. 3 單因素試驗 稱取經(jīng)粉碎過篩的大葉千斤拔葉粉末3 g，按液料比加入一定量提取溶劑，靜止浸泡一定時間后開啟超聲開關，超聲波功率固定為50 W，選擇影響FMLF得率的5個主要因素進行考察，各因素考察水平分別為：乙醇體積分數(shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，液料比9∶1、12∶1、15∶1、18∶1、21∶1、24∶1和27∶1，浸泡時間0、2、4、6、8和10 min，微波功率0、100、200、300、400、500和600 W，提取時間60、90、120、150、180、210和240 s。

1. 2. 4 正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，采用正交設計表L16（45）對超聲—微波協(xié)同提取的影響因素進行正交試驗設計，試驗因素與水平見表1。

1. 2. 5 對比試驗 在優(yōu)選的工藝基礎上，比較單獨超聲提取法、單獨微波提取法和超聲—微波協(xié)同提取法對FMLF得率的影響。單獨超聲提取法工藝條件為：超聲功率50 W、乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1、浸泡時間8 min、提取時間180 s;單獨微波提取法工藝條件為：乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1、浸泡時間8 min、微波功率400 W、提取時間180 s。

1. 2. 6 FMLF體外抗氧化活性測定 將最優(yōu)提取工藝獲得的FMLF進行稀釋，并制備成FMLF質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL的溶液。采用王彥兵等（2019）的Fenton修正法測定FMLF對·OH的清除率，采用張英華和關雪（2012）的鄰苯三酚自氧化法測定FMLF對超氧陰離子自由基（O[-2]·）的清除率，參照陳博文等（2019）的方法測定FMLF對DPPH·的清除率，參照莫曉寧等（2019）的方法測定FMLF對亞硝酸鹽的清除率。

1. 3 統(tǒng)計分析

利用Excel 2019和正交設計助手V3.1對試驗數(shù)據(jù)進行處理及分析，用Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 乙醇體積分數(shù)對FMLF得率的影響 固定浸泡時間6 min、液料比18∶1、微波功率300 W、提取時間180 s，考察乙醇體積分數(shù)對FMLF得率的影響，結果見圖1。由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，F(xiàn)MLF得率呈先升后降的變化趨勢，乙醇體積分數(shù)為60%時達最大值，顯著高于40%、90%和100%的FMLF得率（P<0.05，下同）;當乙醇體積分數(shù)超過60%后，F(xiàn)MLF得率降低。試驗發(fā)現(xiàn)高濃度乙醇在反應器中呈現(xiàn)液態(tài)的量較少，原因可能是高濃度乙醇較易在微波和超聲波作用下大量揮發(fā)，削弱了溶劑溶解有效成分的能力，故乙醇體積分數(shù)以60%為宜。

2. 1. 2 液料比對FMLF得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%、浸泡時間6 min、微波功率300 W、提取時間180 s，考察液料比對FMLF得率的影響，結果見圖2。由圖2可知，隨著液料比的增加，F(xiàn)MLF得率也呈先升后降的變化趨勢，當液料比為18∶1時達最大值，液料比超過18∶1后，F(xiàn)MLF得率反而降低。原因可能是適當增加液料比有利于黃酮溶出，液料比過大則不利于微波和超聲波的作用，反而減少黃酮得率，故液料比以18∶1為宜。

2. 1. 3 浸泡時間對FMLF得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%、液料比18∶1、微波功率300 W、提取時間180 s，考察浸泡時間對FMLF得率的影響，結果見圖3。由圖3可知，大葉千斤拔葉粉末經(jīng)浸泡后黃酮得率顯著高于未浸泡的黃酮得率，且隨著浸泡時間的延長，F(xiàn)MLF得率先快速增加，浸泡時間超過6 min后，F(xiàn)MLF得率增加不明顯，基本趨于平穩(wěn)。從節(jié)約時間和提高效率角度出發(fā)，浸泡時間以6 min為宜。

2. 1. 4 微波功率對FMLF得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%、浸泡時間6 min、液料比18∶1、提取時間180 s，考察微波功率對FMLF得率的影響，結果見圖4。由圖4可知，微波作用可顯著提高FMLF得率，在低功率階段，增加微波功率，F(xiàn)MLF得率提高明顯，微波功率為300 W時達最大值，微波功率超過300 W后，F(xiàn)MLF得率反而快速降低。原因可能是適當增加微波功率有利于提高微波熱效應，促進黃酮類物質(zhì)溶出，當微波功率過大時，則較容易導致溶劑汽化程度增加，溶劑溶解能力下降，黃酮得率反而減少，故微波功率以300 W為宜。

2. 1. 5 提取時間對FMLF得率的影響 固定乙醇體積分數(shù)60%、浸泡時間6 min、液料比18∶1、微波功率300 W，考察提取時間對FMLF得率的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著提取時間的延長，F(xiàn)MLF得率呈先升后降的變化趨勢，當提取時間為180 s時達最大值，之后FMLF得率有所降低。原因可能是適當延長提取時間，相當于增強微波和超聲波的作用，有利于黃酮類化合物溶出，但當提取時間過長時，微波作用更強，反而引起溶劑大量揮發(fā)而降低溶解能力，最終導致黃酮得率降低，故提取時間以180 s為宜。

2. 2 正交試驗結果

由表2正交試驗結果可知，5個因素對超聲—微波協(xié)同提取FMLF的影響排序為：乙醇體積分數(shù)（A）>微波功率（D）>液料比（B）>浸泡時間（C）>提取時間（E），最優(yōu)工藝組合為A2B4C4D3E2，即乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1、浸泡時間8 min、微波功率400 W、提取時間180 s。方差分析結果（表3）表明，因素A、B和D對FMLF提取工藝具有顯著影響，而C和E影響不顯著（P>0.05）。按最優(yōu)工藝條件進行3次提取試驗，F(xiàn)MLF平均得率為60.25 mg/g，高于正交表的任一組合，表明試驗方案設計穩(wěn)定、可行。

2. 3 不同方法提取FMLF的效果對比分析

由圖6可知，超聲—微波協(xié)同提取FMLF的得率顯著高于單獨超聲提取和單獨微波提取，其FMLF得率分別是單獨超聲提取和單獨微波提取的1.55倍和1.16倍。表明超聲—微波協(xié)同技術將振動超聲與開放式微波兩種作用方式相結合，利用兩種提取方法的優(yōu)勢，具有高效率特點。

2. 4 FMLF體外抗氧化活性測定結果

由圖7可知，F(xiàn)MLF對·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸鹽均具有良好的清除作用，且在試驗范圍內(nèi)，F(xiàn)MLF對4種體外抗氧化自由基的清除活性均存在明顯的量效關系，當FMLF質(zhì)量濃度為12.0 mg/mL時，F(xiàn)MLF對亞硝酸鹽、·OH、O[-2]·和DPPH·的清除率分別達93.04%、73.05%、73.82%和82.54%。

參考蔡錦源等（2017）的方法，分別取前5組數(shù)據(jù)進行線性回歸，所得結果見表4。由表4可知，在低濃度下FMLF質(zhì)量濃度與4種體外抗氧化活性指標的判定系數(shù)R2均接近1，該值越接近1，說明模型的擬合優(yōu)度越高。FMLF對·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸鹽的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL。

3 討論

超聲輔助是提取植物總黃酮的常用方法，其作用機理主要是利用超聲波的熱效應、機械粉碎作用及空化作用等，熱效應使植物內(nèi)部組織的溫度迅速升高，有利于被提取物中有效成分流出，超聲波的機械粉碎作用能引起細胞結構損傷，使組織細胞內(nèi)活性物質(zhì)釋放、擴散及溶解，以提高黃酮類化合物的提取量（孫艷和楊志偉，2016;宋志姣等，2020;王彥兵等，2020）。微波輔助也是提取植物總黃酮的常用方法，在微波提取過程中，浸入到植物原料中的溶劑分子吸收微波，熱運動加劇，溫度升高破壞細胞壁，使細胞內(nèi)物質(zhì)溶出，而在電磁場作用下，有效成分隨溶劑加速從被萃取的物料內(nèi)部向外部溶劑中擴散，以提高黃酮類化合物的提取量（Cheng et al.，2013;劉韜等，2015）。本研究以FMLF得率為優(yōu)選指標，參照大葉千斤拔根黃酮提取工藝的主要影響因素，選取乙醇體積分數(shù)、液料比、浸泡時間、微波功率和提取時間5個因素進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗設計，并采用直觀分析和方差分析優(yōu)選FMLF的超聲—微波協(xié)同提取工藝參數(shù)，得到的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1、浸泡時間8 min、微波功率400 W、提取時間180 s，該工藝條件下FMLF得率可達60.25 mg/g，優(yōu)于陳帥等（2013）采用正交試驗法優(yōu)化千斤拔總黃酮微波提取工藝的結果。此外，超聲—微波協(xié)同提取FMLF顯著優(yōu)于單獨微波提取法和單獨超聲提取法。該技術將振動超聲與開放式微波兩種作用方式相結合，充分利用超聲振動的空化作用及微波的高能作用，使樣品各點內(nèi)受到的作用一致，從而降低目標物與樣品基體的結合力，加速目標物從固相進入溶劑中（龐敏等，2016;Xu et al.，2018;唐雅瑜等，2019），有利于FMLF得率的提高。

目前有關大葉千斤拔黃酮的提取及活性研究主要原料是根部（蔡錦源等，2016;王巖等，2017），而對其莖葉中黃酮的提取及活性研究未見報道。本研究對FMLF進行提取，并研究其抗氧化活性，結果發(fā)現(xiàn)其對·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸鹽均具有良好的清除活性，且在試驗范圍內(nèi)，F(xiàn)MLF對4種體外抗氧化自由基的清除活性均存在明顯的量效關系，當FMLF質(zhì)量濃度為12.0 mg/mL時，F(xiàn)MLF對亞硝酸鹽、·OH、O[-2]·和DPPH·的清除率分別達93.04%、73.05%、73.82%和82.54%，IC50分別為1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL，表明FMLF與大葉千斤拔根的黃酮一樣，具有一定的抗氧化性，可作為一種天然的抗氧化活性劑，但其清除機理及其他方面的生物活性有待進一步研究。

4 結論

采用正交試驗設計法優(yōu)化的超聲—微波協(xié)同提取工藝條件（乙醇體積分數(shù)60%、液料比21∶1、浸泡時間8 min、微波功率400 W、提取時間180 s）可用于FMLF的提取，該法提取FMLF優(yōu)于單獨微波提取法和單獨超聲提取法，且提取得到的FMLF具有較強的抗氧化能力，可開發(fā)作為一種天然抗氧化劑。

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（責任編輯 羅 麗）