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        不同氨基酸對(duì)泰萬菌素發(fā)酵影響的研究

        2021-04-19 11:33:12石彥鵬
        中國(guó)獸藥雜志 2021年1期
        關(guān)鍵詞:亮氨酸甘氨酸色氨酸

        劉 楊,張 萍,石彥鵬,牛 春

        (寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)中心,銀川 寧夏 750101)

        泰萬菌素又稱乙酰異戊酰泰樂菌素,是由英國(guó)伊科動(dòng)物保健品有限公司研發(fā)的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。2004年9月9日經(jīng)歐盟批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療由豬肺炎支原體引起的豬氣喘病、由豬痢疾短螺旋體引起的豬痢疾、由胞內(nèi)勞森氏菌引起的豬增生性腸炎和由雞毒支原體引起的雞支氣管感染[1];2012年7月6日經(jīng)由FDA批準(zhǔn)用于預(yù)防由胞內(nèi)勞森氏菌引起的豬增生性腸炎[2]。目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)酒石酸泰萬菌素預(yù)混劑和可溶性粉用于預(yù)防和治療豬、雞支原體感染和豬血痢短螺旋體以及其他敏感細(xì)菌感染[3]。具有低毒、高效、低殘留等優(yōu)點(diǎn),并不產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之間的交叉感染,是一類較好的治療呼吸道和消化道感染的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[3]。該產(chǎn)品目前尚屬國(guó)際專利保護(hù)期,該專利屬于日本美露香公司,2002年英國(guó)依科公司買斷?,F(xiàn)英國(guó)依科公司委托山東魯抗委托加工。

        抗生素發(fā)酵單位是標(biāo)志生產(chǎn)水平的重要指標(biāo),研究表明,在泰萬菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中加入氨基酸對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵單位都具有顯著影響[3-5]。為此,本研究對(duì)泰萬菌素發(fā)酵培養(yǎng)基中的氨基酸種類進(jìn)行了研究,獲得對(duì)其發(fā)酵過程影響最大的氨基酸為亮氨酸,賴氨酸和甘氨酸。在此基礎(chǔ)上用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)氨基酸比例進(jìn)行了優(yōu)化,明顯提高了泰萬菌素的轉(zhuǎn)化率。

        1 材料與方法

        1.1 菌種 耐熱鏈霉菌16-926 菌種由本公司實(shí)驗(yàn)室保藏。

        1.2 原材料 葡萄糖(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司);玉米漿(華北制藥康欣有限公司);胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);可溶性淀粉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);棉籽餅粉(大荔偉恒生物科技有限公司);玉米蛋白粉(內(nèi)蒙阜豐生物科技有限公);聚醚消沫劑(宜新市江山生物科技有限公司);亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、甘氨酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

        1.3 儀器設(shè)備 Waters 600高效液相色譜儀(美國(guó)Waters);UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津);TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科技有限公司);BSA2202S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);PHS-3C精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);CX31型顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)。

        1.4 菌種培養(yǎng)基[6]斜面培養(yǎng)基:胰胨豆湯培養(yǎng)基:胰胨豆湯粉30 g,蒸餾水1000 mL。

        種子瓶培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,大豆粉20 g,磷酸氫二鉀0.5 g,七水硫酸鎂 0.5 g,Yeast extract 1.0 g。

        發(fā)酵瓶培養(yǎng)基:可溶性淀粉60 g,大豆粉20 g,酵母粉 4 g,七水硫酸鎂 5 g,棉籽粉7 g,Yeast extract 1.0 g。

        1.5 方法

        1.5.1 氨基酸的選擇

        1.5.1.1 單因素

        表1 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的單因素水平表

        1.5.1.2 多因素

        表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的組合水平表

        1.5.1.3 氨基酸比例

        表3 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種氨基酸的不同比例水平表

        1.5.2 發(fā)酵瓶的培養(yǎng) 用無菌的不銹鋼鏟在無菌條件下鏟取1.5~2 cm2左右的菌絲體接種于種子瓶,置溫度29 ℃,濕度30~50%,轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖瓶機(jī)上振蕩培養(yǎng) 48 h,補(bǔ)入底物繼續(xù)轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖瓶機(jī)上振蕩培養(yǎng)144 h發(fā)酵培養(yǎng)。

        1.5.3 發(fā)酵瓶T2i5含量測(cè)定方法 稱取發(fā)酵液1 mL溶于無水甲醇溶液5 mL,超聲振蕩器振蕩2~3 min,充分混勻后用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后備用。高效液相色譜條件 Agilent Extend-C 18色譜柱,柱溫:40 ℃。流動(dòng)相:A相為0.1%甲醇水溶液,B相為乙腈;流速為0.4 mL/min。進(jìn)樣體積為5 μL[7]。

        1.5.4 核酸檢測(cè)方法 稱取發(fā)酵液2 mL于10 mL離心管中高速離心機(jī)離心,棄去上清液,加入10%三氯乙酸溶液旋渦振蕩1~2 min,高速離心機(jī)離心,棄去上清液,加入5%三氯乙酸溶液旋渦振蕩1~2 min,沸水浴30 min,冷卻后高速離心機(jī)離心,取上清液加入純化水中充分混搖,紫外分光光度計(jì)290 nm處比色。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同氨基酸(單因素)對(duì)發(fā)酵過程的影響

        由圖1可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入亮氨酸或甘氨酸PH值在工藝范圍之內(nèi),賴氨酸與色氨酸的PH值或高于工藝范圍、或低于工藝范圍。

        圖1 不同氨基酸(單因素)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中PH值的影響

        圖2 不同氨基酸(單因素)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中核酸的影響

        由圖2可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入亮氨酸或甘氨酸核酸含量明顯大于賴氨酸與色氨酸。

        圖3 不同氨基酸(單因素)對(duì)發(fā)酵過程中T2i5含量的影響

        由圖3可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入亮氨酸或甘氨酸T2i5含量明顯大于賴氨酸與色氨酸。

        2.2 不同氨基酸(多因素)對(duì)發(fā)酵過程的影響

        表4 不同氨基酸(多因素)對(duì)發(fā)酵過程中的影響

        由表4可知,發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入亮氨酸、色氨酸和甘氨酸在PH值、核酸含量和T2i5含量方面明顯優(yōu)于其他組合,對(duì)其比例再次進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

        2.3 氨基酸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)氨基酸作了四因素三水平(L934)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)其它不變,其試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表5~表6。

        表5 搖瓶發(fā)酵正交結(jié)果

        表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

        從表5、表6可以看出,4號(hào)實(shí)驗(yàn)搖瓶效價(jià)最高,平均達(dá)到16980 μ/mL,再通過直觀分析和方差分析發(fā)現(xiàn),亮氨酸對(duì)搖瓶效價(jià)的影響比較大,為主要影響因子。根據(jù)結(jié)果選4號(hào)配方和A0.2B0.2C0D0.1配方作進(jìn)一步驗(yàn)證,同時(shí)用原配方作為對(duì)照,驗(yàn)證結(jié)果如表7。

        表7 與原配方對(duì)比結(jié)果

        3 結(jié)果與討論

        大環(huán)內(nèi)酯類抗生素內(nèi)酯環(huán)的形成需要乙酸、丙酸和丁酸作為前體物質(zhì),而這些物質(zhì)來源于三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝等途徑。主要考察了亮氨酸、賴氨酸、色氨酸和甘氨酸作為泰萬菌素生物合成前體物質(zhì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明亮氨酸、賴氨酸、甘氨酸對(duì)泰萬菌素發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵單位具有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn),單一加入亮氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值一直維持在工藝范圍之內(nèi),核酸含量和T2i5含量均為最高;單一加入賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值最低超過工藝范圍,核酸含量和T2i5含量均為最低;單一加入色氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值最高超過工藝范圍,進(jìn)而影響核酸含量和T2i5含量只高于賴氨酸;單一加入甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基PH值在工藝范圍之內(nèi),核酸含量和T2i5含量均稍低于亮氨酸,而高于色氨酸和賴氨酸。因此說明氨基酸單因素因子中亮氨酸、色氨酸、甘氨酸起顯著作用。

        由于考慮到不同氨基酸種類之間對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的影響,再次對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸種類進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中同時(shí)加入亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三種氨基酸的PH值、核酸含量和T2i5含量最優(yōu),同時(shí)對(duì)亮氨酸、色氨酸、甘氨酸三種氨基酸進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出其最優(yōu)比例為亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%。因此確定亮氨酸、色氨酸、甘氨酸為泰萬菌素發(fā)酵影響顯著因子。在原培養(yǎng)基配方中按照亮氨酸0.2%、色氨酸0.1%、甘氨酸0.2%比例加入三種氨基酸,使得搖瓶效價(jià)從14000 μ/mL提高到18000 μ/mL,效價(jià)提高了28.5%

        結(jié)果表明亮氨酸、色氨酸、甘氨酸加入到發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)泰萬菌素發(fā)酵轉(zhuǎn)化率影響顯著。目前世界范圍內(nèi)氨基酸種類具有36種,實(shí)驗(yàn)只對(duì)實(shí)驗(yàn)室常見的幾種氨基酸進(jìn)行了試驗(yàn),不同氨基酸對(duì)泰萬菌素發(fā)酵影響還可以進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍。

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