李偉杰，田 野，豈曉鑫，魏財文，李 建，張一幟，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

細菌分類學(xué)始于19世紀后半葉，起初采用表型分類方法進行簡單分類，但在揭示細菌間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面具有局限性[1]。20世紀60年代，DNA-DNA雜交(DNA-DNA hybridization，DDH)被稱為分類學(xué)中的“金標準”，70%的DNA-DNA的雜交值已被作為種間閾值在原核生物的分類中得到廣泛應(yīng)用[2-3]，現(xiàn)在可以用細菌的全基因組序列進行數(shù)字DNA-DNA雜交值的計算[4]。20世紀80年代后，因序列保守且不受水平基因轉(zhuǎn)移的影響，16S rRNA基因序列分析方法被廣泛用來細菌分類鑒定，種間閾值經(jīng)歷了97%、98.7%～99.0%、98.2%～99.0%、98.65%的變化[5-8]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，比表型特征和基因片段序列分析更精確的基于全基因組序列分析的方法被用于細菌分類，主要的分析方法包括平均核苷酸同源性(Average nucleotide identity, ANI)[9]、基因組局部相似性搜索距離系統(tǒng)發(fā)育分析(Genome blast distance phylogeny, GBDP)[10]、最大唯一匹配指數(shù)分析(Maximal unique matches index, MUMi)[11]。其中ANI被廣泛使用和認可，95%～96%的ANI值等同于70%的DDH值，相對應(yīng)于98.65%的16S rRNA基因同源性，使其成為下一代細菌鑒定金標準的候選[8]。本文對《中華人民共和國獸藥典》三部2015年版收載的羊敗血性鏈球菌病疫苗生產(chǎn)檢驗用菌種CVCC 553、55001和55002[12]，按現(xiàn)有細菌分類鑒定方法進行了系統(tǒng)分類鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種 CVCC 553、55001和55002由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物中心提供，為羊敗血性鏈球菌病疫苗生產(chǎn)檢驗用菌種。

1.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，BUG培養(yǎng)基購自Biolog公司，緩沖肉湯培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.3 試劑 馬血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，無菌脫纖維綿羊血自采，革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，PCR相關(guān)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，鏈球菌乳膠分群試劑盒購自丹麥國家血清研究院，C1接種液和Gen III鑒定板購自Biolog公司。

1.4 菌種的培養(yǎng) 無菌開啟菌種CVCC 553、55001和55002凍干安瓿瓶，用TSB肉湯充分溶解，接種含5%馬血清的TSA平板，37 ℃，5%CO2，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接含5%馬血清的TSA平板，連續(xù)純化2代后接種含5%馬血清的TSA平板和含10%無菌脫纖維綿羊血瓊脂平板，37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)18 h～24 h后觀察。

1.5 菌種的革蘭染色 革蘭染色參照說明書操作。

1.6 菌種血清群的鑒定 用鏈球菌乳膠分群試劑盒中亞硝酸提取試劑，參照說明書操作步驟，提取鏈球菌群特異性多糖抗原，與分群血清進行反應(yīng)，30 s內(nèi)判定結(jié)果。

1.7 菌種Biolog鑒定 取菌種CVCC 553、55001和55002的純培養(yǎng)物劃線接種含5%脫纖維綿羊血的BUG培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2，培養(yǎng)24 h。將一次性棉簽用C1接種液稍微浸濕，然后蘸取單菌落在試管內(nèi)壁接種液液面上方干燥部位，旋轉(zhuǎn)擠壓棉簽，盡量使菌落分散，然后上下移動棉簽，將分散的菌落和接種液充分混合，形成均一、無團塊的菌懸液，調(diào)整濁度范圍在96%～98%。靜置片刻后將菌懸液接種到Gen III鑒定板中，100 μL/孔，放置在濕盒中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，通過Biolog微生物鑒定系統(tǒng)MicroStation中的軟件讀取Gen III鑒定板上菌種的表型圖譜。

1.8 菌種16S rRNA序列測定和分析 菌種CVCC 553、55001和55002的DNA提取和16S rRNA的擴增參照文獻[13]， PCR產(chǎn)物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成序列測定。用Bioedit軟件對16S rRNA測序結(jié)果進行質(zhì)控和序列拼接，拼接后的序列提交到https:∥www.ezbiocloud.net/進行比對，選取相似性高的菌株序列，利用MEGA-X軟件中的Clustal W方法進行同源性比對，采用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)獲得分支系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度經(jīng)重抽樣法1000次重復(fù)檢測，DNA序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦予相同的加權(quán)值。

1.9 菌種的全基因組序列測定和分析 菌種CVCC 553、55001和55002全基因組的提取使用細菌基因組DNA提取試劑盒，DNA經(jīng)檢測合格后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定，在https:∥www.dsmz.de/在線計算DNA-DNA的雜交值[4]，在https:∥www.ezbiocloud.net/在線計算平均核苷酸同源性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種染色特性及菌體形態(tài) 菌種CVCC 553、55001和55002均為革蘭陽性球菌，呈單個、成對和短鏈排列。

2.2 菌種菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性 菌種CVCC 553、55001和55002在含10%無菌脫纖維綿羊血平板上培養(yǎng)18 h形成灰色、半透明、濕潤、黏稠菌落，在含10%無菌脫纖維綿羊血平板上培養(yǎng)24 h后呈β溶血。

2.3 菌種血清分群結(jié)果 用鏈球菌蘭氏分群試劑盒提取菌種CVCC 553、55001和55002的抗原，在反應(yīng)卡上與含乳膠顆粒的分群血清進行反應(yīng)，30 s內(nèi)菌種CVCC 553、55001和55002只與鏈球菌蘭氏C群血清發(fā)生凝集反應(yīng)，形成藍色的顆粒狀凝集物(圖1)，而與A、B、D、F、G群血清不發(fā)生凝集反應(yīng)，判定菌種CVCC 553、55001和55002為蘭氏C群。

A：CVCC 553，B：CVCC 55001，C：CVCC 55002

2.4 菌種Biolog鑒定結(jié)果 根據(jù)對71種碳源利用情況以及對23種化學(xué)物質(zhì)敏感性的結(jié)果，菌種CVCC 553、55001和 55002經(jīng)Biolog鑒定均為馬鏈球菌反芻亞種。

2.5 菌種的16S rRNA序列分析結(jié)果 將菌種CVCC 553、55001和55002的16S rRNA序列拼接后提交到https:∥www.ezbiocloud.net/進行比對，用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果菌株CVCC 553、55001和55002與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CECT 5772的同源性最高，均為99.72%，與馬鏈球菌馬亞種模式菌株ATCC 33398和獸疫亞種模式菌株NCTC 4676的同源性分別均為97.68%、97.73%和97.71%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株CVCC 553、55001和55002與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CECT 5772位于同一分支(圖2)。

2.6 菌種的全基因組序列分析結(jié)果 菌種CVCC 553、55001和55002掃描圖序列大小分別為2124577 bp、2186173 bp、2178262 bp，G+C mol%分別為41.0、41.1、41.0。將菌種CVCC 553、55001和55002掃描圖序列提交到https:∥www.dsmz.de/進行全基因組序列分析[6]，結(jié)果顯示菌種CVCC 553、55001和55002均與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CCUG 47520的DNA-DNA的雜交值最高，分別為80.5%、80.2%、80.5%(表1)。將菌種CVCC 553、55001和55002掃描圖序列提交到https:∥www.ezbiocloud.net/計算平均核苷酸同源性[7]，菌種CVCC 553、55001和55002與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CECT 5772、獸疫亞種模式菌株NCTC 4676和馬亞種模式菌株ATCC 33398的ANI值分別為97.73%、95.42%、96.22%，97.64%、95.51%、96.11%，97.77%、95.47%、96.04%。

3 討論與結(jié)論

馬鏈球菌目前分為3個亞種，分別為馬亞種、獸疫亞種和反芻亞種[15-16]。其中馬亞種只引起馬、騾、驢的馬腺疫[16-17]；獸疫亞種可致多種動物疫病，包括馬的敗血癥和子宮炎、牛的乳腺炎和子宮炎、豬的敗血癥和關(guān)節(jié)炎、羔羊和幼犬?dāng)⊙Y和肺炎等[17]；反芻亞種可引起綿羊和山羊的乳腺炎，2004年由Fernández等依據(jù)表型和基因型首先報道了該亞種[15]。我國獸藥典中收載的羊敗血性鏈球菌病疫苗是1973年青海獸醫(yī)生物藥品廠研制，生產(chǎn)檢驗用菌種為馬鏈球菌CVCC 553、55001和55002。通過查閱現(xiàn)存檔案，菌種CVCC 553、55001和55002最早的鑒定報告中采用形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性及血清學(xué)特性來確定其分類地位，其中生化反應(yīng)采用的是糖發(fā)酵管，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、山梨醇陽性，纖維二糖、甘露醇、棉子糖、鼠李糖、松三糖、水楊素、菊糖、樹膠醛糖、木糖、七葉苷陰性。根據(jù)細菌鑒定的要求，僅依據(jù)以上鑒定項目不能在種水平上得出菌種CVCC 553、55001和55002是馬鏈球獸疫亞種的結(jié)論。

表1 菌種CVCC 553、55001和55002 DNA-DNA雜交值

基于以上菌種鑒定過程中存在的問題，本文采用染色特性及菌體形態(tài)、菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性、血清分群、Biolog鑒定、16S rRNA序列分析和全基因組序列分析對羊敗血性鏈球菌病疫苗生產(chǎn)檢驗用菌種CVCC 553、55001和55002進行了系統(tǒng)分類鑒定，結(jié)果表明菌種的形態(tài)和培養(yǎng)特性與《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二○○○年版中的規(guī)定一致，但Biolog給出的結(jié)果均為馬鏈球菌反芻亞種，16S rRNA序列與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CECT 5772同源性最高且處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，基于全基因組序列的DNA-DNA的雜交值與馬鏈球菌反芻亞種模式菌株CCUG 47520最高，分別為80.5%、80.2%、80.5%，均大于70%。以上結(jié)果都表明羊敗血性鏈球菌病疫苗生產(chǎn)檢驗用菌種CVCC 553、55001和55002為馬鏈球菌反芻亞種，而不是原命名的馬鏈球菌獸疫亞種。在以上鑒定的基礎(chǔ)上，對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國家獸醫(yī)微生物中心保藏的分離自青海、甘肅患敗血癥綿羊心血的4株馬鏈球菌CVCC 549、550、551、552進行了系統(tǒng)分類鑒定，結(jié)果表明均為馬鏈球菌反芻亞種。

本研究從表型水平和基因型水平對羊敗血性鏈球菌病疫苗生產(chǎn)檢驗用菌種CVCC 553、55001和55002進行了系統(tǒng)分類鑒定，結(jié)果為《中華人民共和國獸藥典》的修訂提供了技術(shù)支持，同時也明確了馬鏈球菌反芻亞種可引起羊敗血性鏈球菌病。