蘇世博蒲路莎陳肖韓趙麗麗陳洪巖

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家禽類實(shí)驗(yàn)動物資源庫,哈爾濱 150069)

禽類星狀病毒(avian astroviruses,AAstVs)屬于星狀病毒科(astroviridae,AstV),其基因組長度介于7 kb到8 kb 之間,該病毒為單股正鏈RNA 病毒,無囊膜結(jié)構(gòu),粒子直徑為28 ～30 nm,呈二十面體星狀結(jié)構(gòu)[1]。禽星狀病毒多發(fā)于養(yǎng)殖禽和少數(shù)鳥類,如火雞(TAstV)、鴨子(DAstV)、雞(CAstV)、珍珠雞(GFAstV)、鴿子(PiAstV)以及少數(shù)野生水生和陸棲鳥類[2]。據(jù)報(bào)道,通常情況下感染星狀病毒的禽類主要表現(xiàn)為病毒性胃腸炎、肝炎以及間質(zhì)性腎炎[3-5]。然而自2017 年來,中國多個(gè)省份的鵝場都發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種以致命的內(nèi)臟和關(guān)節(jié)痛風(fēng)為主要臨床特征的水禽傳染性疾病,該病多發(fā)于雛鵝,且具有高度致死性,死亡率為30%～50%[6]。病死雛鵝剖檢通常表現(xiàn)心、肝等主要臟器的痛風(fēng)癥狀,其表面附著大量白色尿酸鹽顆粒,腎及腸系膜充血腫脹,嚴(yán)重者全身肌肉關(guān)節(jié)處均表現(xiàn)痛風(fēng)。該病給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7]。經(jīng)過病原學(xué)檢測,研究者們從各個(gè)地區(qū)臨床樣本中相繼分離并鑒定出一種與已報(bào)道的禽星狀病毒遺傳學(xué)差異較大的新型星狀病毒[8-12],并命名為鵝源星狀病毒(gooseorigin astrovirus,GoAstV)。與其他種屬星狀病毒基因組結(jié)構(gòu)類似,鵝源星狀病毒基因組包含三個(gè)主要的開放閱讀框架(ORF1a、ORF1b 和ORF2),以及一個(gè)短的 5’非編碼區(qū)(UTR)、一個(gè) 3’UTR 和一個(gè)PolyA 尾巴[13-14]。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒復(fù)制中發(fā)揮作用,且較編碼病毒粒子衣殼蛋白(Cap)的 ORF2 序列更為保守。自 2018 年以來,黑龍江省[15]也出現(xiàn)了該病的大規(guī)模流行,其發(fā)病率高達(dá)80%,死亡率高達(dá)50%,這表明這種新型病毒正在向中國東北地區(qū)迅速傳播。經(jīng)鑒定和測序分析發(fā)現(xiàn)該病毒與已報(bào)道的鵝源星狀病毒同源性高度相近,均不低于96.0%,遺傳進(jìn)化分析表明它們屬于同一分支。但與其他禽類星狀病毒具有較明顯差異,其全基因組同源性僅為44.7%～60.5%。

早期,研究者僅能使用電子顯微鏡進(jìn)行禽類星狀病毒的診斷[16],不利于大規(guī)模的臨床檢驗(yàn)。由于該新型星狀病毒缺乏體外培養(yǎng)細(xì)胞系,且無血凝作用,使血清學(xué)檢測方法相對較少。普通RT-PCR 方法成為快速檢測該病毒的主要方式之一,但該方法敏感性低,無法對病毒定量分析,因此建立熒光定量PCR 方法十分必要。目前有研究者建立了SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法[17],并探究了該病毒的組織嗜性。但相比于該方法,TaqMan 探針熒光定量在對目的基因進(jìn)行絕對定量方面優(yōu)勢明顯[18],于是本實(shí)驗(yàn)以前期分離到的GoAstV HLJ01 株為毒種,利用參考毒株序列進(jìn)行比對,并選取ORF1a 中的保守片段設(shè)計(jì)并合成特異性引物及探針,通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行一系列的靈敏性、重復(fù)性及特異性實(shí)驗(yàn),最終建立一種更加高效特異的TaqMan 探針熒光定量PCR 方法,該方法將對GoAstV 的早期檢測及后期流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐,對該疾病的治療和預(yù)防更具指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

GoAstV HLJ01 株(GenBank 登錄號:MN175321.1)為本實(shí)驗(yàn)室2018 年從黑龍江省大慶市某鵝場病死雛鵝肝、腎組織分離獲得。新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV) H1、H5、H9 的 HI 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨腸炎病毒(DEV)、鵝細(xì)小病毒(GPV)、鴨肝炎病毒 1 型和 3 型(DHV-1、DHV-3)等由本實(shí)驗(yàn)室保存。臨床樣品采自黑龍江省部分地區(qū)疑似發(fā)病的鵝養(yǎng)殖場5 月齡霍爾多巴吉鵝,共50份肛拭子。

1.2 主要試劑與儀器

TIANamp Virus RNA Kit 購于天根生化科技有限公司;Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit 均購自美國 OMEGA BioTek 公司;2×Taq PCR StarMix 購自GenStar 公司; T4 DNA 連接酶、pMD19-T 載體均購自于寶生物工程(大連)有限公司;DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、TransStart Probe qPCR SuperMix、2,000 bp DNA Marker 購自北京全式金有限公司;組織研磨儀購自德國 QIAGEN 公司; 三槽 模塊 PCR 儀購 自SensoQuest 公司;Bio-Rad IQ5 熒光定量 PCR 系統(tǒng)購自于美國伯樂公司;凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha technoch 公司;電泳儀購自北京六一儀器廠;超微量紫外分光光度計(jì)購自于德國IMPLEN 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)和合成

從GenBank 中下載 GoAstV 參考序列,使用DNA STAR 軟件進(jìn)行序列比對分析,并用Primer 5軟件對ORF1a 閱讀框中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增產(chǎn)物大小在400 bp 標(biāo)準(zhǔn)品引物(AstV-F-1050/AstVR-1428),利用其擴(kuò)增產(chǎn)物制備標(biāo)準(zhǔn)品,在標(biāo)準(zhǔn)品序列中再選取一段長度為107 bp 的保守片段,設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物(PPF/PPR),同時(shí)設(shè)計(jì)一條5’端熒光基團(tuán)為FAM,3’端淬滅基團(tuán)為TAMRA 的特異性探針(Probe)。上述兩對引物及一條探針均由吉林庫美生物科技有限公司合成(表1)。

1.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

按照病毒RNA 提取試劑盒的說明書提取GoAstV HLJ01 株病毒RNA,并依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明以病毒RNA 為模板依次進(jìn)行基因組DNA 的清除和病毒cDNA 的合成。以得到的cDNA 為模板,利用引物AstV-F-1050/AstV-R-1428 對標(biāo)準(zhǔn)品目的片段進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系:2×Taq PCR StarMix 10 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 補(bǔ)充至 20 μL;反應(yīng)條件:94℃ 5min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃40 s,34 cycles;72℃ 10 min;12℃終止。將 PCR 產(chǎn)物核酸膠電泳后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下切取目的片段進(jìn)行回收純化,并按照pMD-19T 連接體系連接克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落于LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),經(jīng)菌液PCR 鑒定正確后提取陽性質(zhì)粒送測序,將測序結(jié)果與理論相符的陽性質(zhì)粒命名為pMD-19T-G,-80℃保存?zhèn)溆谩y定pMD-19T-G 濃度,并進(jìn)行10 倍的倍比稀釋,將其作為TaqMan 熒光定量PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

首先分別將引物(PPF/PPR)和探針稀釋至10 μmol/L,以總反應(yīng)體系 20 μL、模板量 1μL、探針量0.4μL 為基礎(chǔ),進(jìn)行 TaqMan 熒光定量 PCR 反應(yīng),根據(jù)CT 值及曲線狀況摸索上下游引物的加樣量[19]。再以此濃度的上下游引物為標(biāo)準(zhǔn),控制模板量不變,分別加入 0.2 μL、0.4 μL、0.8 μL 的探針摸索最佳的工作濃度[19]。

1.3.4 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品pMD-19T-G 進(jìn)行10 倍梯度稀釋得到8 個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(每微升1.50×102～1.50×109拷貝)作為模板,每個(gè)模板均做3 個(gè)重復(fù),在優(yōu)化得到的反應(yīng)條件進(jìn)行熒光動力學(xué)擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增曲線確定閾值并利用CT 值及模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)之間的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出標(biāo)準(zhǔn)方程[19],同時(shí)以無菌水為模板設(shè)置陰性對照。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證該方法的特異性,提取GoAstV HLJ01 株、NDV、(AIV) H1、H5、H9、DTMUV、DHV-1 和 DHV-3的病毒基因組RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;用病毒DNA試劑盒提取 GPV、DEV 和 MDPV 的基因組 DNA。利用上述建立的方法對提取的各種水禽病毒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng),以無菌水為模板作空白對照。

1.3.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

鑒定該方法的靈敏度,使用DEPC 水10 倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒得到每微升1.50×109～1.50×102拷貝的質(zhì)粒模板并進(jìn)行敏感性檢測,采用無菌水作為模板作空白對照。檢測方法的靈敏度為以CT<35 且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S 型擴(kuò)增曲線的最低濃度[20]。

1.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取3 個(gè)稀釋度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(10-2、10-4、10-6)進(jìn)行檢測,并分別進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn);使用相同模板樣品在3 個(gè)不一致的時(shí)間點(diǎn)來進(jìn)行批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。據(jù)以上兩批實(shí)驗(yàn)得到的CT 值計(jì)算各自批內(nèi)和批間的變異系數(shù),以此來判定該方法的可靠性[21]。

1.3.8 臨床樣品檢測

使用普通RT-PCR 方法與本研究建立的探針法定量檢測樣品方法分別對從黑龍江部分地區(qū)發(fā)病鵝場采集的50 份疑似發(fā)病雛鵝的肛拭子進(jìn)行檢測,利用檢測結(jié)果計(jì)算其符合率并判斷新方法的優(yōu)越性。

表1 熒光定量PCR 相關(guān)引物Table 1 The primers used for the fluorogrnic quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

利用 AstV-F-1050、AstV-R-1428 引物對 HLJ01株進(jìn)行常規(guī)RT-PCR 反應(yīng),獲長度400 bp 的單一條帶(圖1)。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆、測序,結(jié)果與預(yù)期完全一致,將構(gòu)建成功的陽性質(zhì)粒命名為pMD-19T-G,-80℃保存?zhèn)溆?。使用分光光度?jì)測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 OD 值為:50.8 ng/μL。據(jù)公式得出 pMD-19T-G 標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為每微升1.50×1010拷貝。

2.2 熒光定量PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)過多次試驗(yàn)摸索后得到熒光定量PCR 最佳反應(yīng)體系:2×Probe qPCR SuperMix 10 μL、探針(10μmol/L) 0.4 μL、上游引物(10μmol/L) 0.4 μL、下游引物(10μmol/L)0.4 μL、模板 1 μL、Nucleasefree Water 7.8 μL,總體系 20μL。反應(yīng)條件為:94℃30 s;94℃ 5 s,60℃ 30 s,45 個(gè)循環(huán);4℃終止反應(yīng)。

注:M:DL2000 DNA Marker;1:目的基因; 2:陰性對照。圖1 目的片段PCR 結(jié)果Note.M,DL 2000 marker;Line 1,Objective fragments;Line 2,Negative control.Figure 1 Amplification products of the PCR test

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以稀釋好的8 個(gè)濃度梯度(1.5×102至1.5×109copies/μL)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,且每個(gè)梯度做4個(gè)重復(fù)進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。分析擴(kuò)增結(jié)果,分別以質(zhì)粒模板量的對數(shù)值作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo),以熒光信號達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)(CT)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線方程為:Y=-3.179x+42.066。如圖2 所示每個(gè)濃度梯度的樣本均準(zhǔn)確位于曲線上,體現(xiàn)了良好的線性關(guān)系,且相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999,重復(fù)性良好。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對 GoAstV、NDV、(AIV)H1、H5、H9、DHV-1、DHV-3、DTMUV、GPV、DEV、MDPV 進(jìn)行熒光動力學(xué)擴(kuò)增,結(jié)果只有GoAstV 檢測出陽性,其他供試病原均為陰性(圖3)。結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

圖2 GoAstV 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The standard curve of GoAstV Real-time PCR

注:1:GoAstV;2-11: NDV、H9、H1、H5、DHV-1、DHV-3、DTMUV、MDPV、GPV、DEV;12:陰性對照。圖3 TaqMan 熒光定量PCR 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Note.1, GoAstV.2-11, NDV/H9/H1/H5/DHV-1/DHV-3/DTMUV/MDPV/GPV/DEV.12, Negative control.Figure 3 Results of specific test of TaqMan real-time PCR

2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對于敏感性實(shí)驗(yàn),將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋(每微升1.50×109拷貝至1.50×102拷貝)用作熒光動力學(xué)檢測的模板,并以CT<35 的情況下呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線作為判定該方法的靈敏度的依據(jù)。如圖4 所示,該方法的檢出限低至每微升1.5×102拷貝。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取3 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品(1.50×104copies /μL、1.50×106copies /μL、1.50×108copies /μL)分別進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果中CT 值分別計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。結(jié)果如表2 可知批內(nèi)實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)小于0.5%,批間試驗(yàn)變異系數(shù)均小于4%,證明該方法的重復(fù)性良好且具有較高的可靠性。

2.7 臨床樣品的檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以常規(guī)RT-PCR,TaqMan 熒光定量PCR兩種方法對該50 份疑似發(fā)病雛鵝的肛拭子進(jìn)行檢測,分析結(jié)果使用熒光定量PCR 檢出所有樣品均為GoAstV 陽性(50/50),而 RT-PCR 方法的 GoAstV 陽性率為84%(42/50),兩者陽性符合率和吻合度達(dá)84%,再次證明該方法較RT-PCR 方法靈敏度更高。

3 討論

GoAstV 由我國科學(xué)家于2017 年首次報(bào)道,此后該病毒引發(fā)的雛鵝內(nèi)臟痛風(fēng)病在我國東部省份廣泛流行,是近幾年嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要疾病。目前常用RT-PCR 檢測。然而,該方法靈敏度不高且需要凝膠電泳,不適合大量臨床樣本的快速檢測。此外RT-PCR 檢測只能做定性分析,不能準(zhǔn)確定量。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展,SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法和TaqMan 探針熒光定量PCR 方法相繼出現(xiàn)。近年來,先后有研究者選取GoAstV ORF1b 的RdRp 基因構(gòu)建了GoAstV 熒光定量PCR 檢測方法[17,22-23],臨床應(yīng)用證實(shí),其方法能快速、有效地檢測GoAstV,但SYBR Green I 熒光定量PCR 方法只能做到相對定量,TaqMan 探針法則可以做到病毒載量的絕對定量,且TaqMan 探針在引物特異的基礎(chǔ)上再次提高了檢測的特異性[24]。

本實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上也建立了針對GoAstV ORF1a 基因保守區(qū)域的GoAstV 高靈敏度強(qiáng)特異性的TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測平臺,并將該方法初步應(yīng)用于臨床樣品。首先通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,最終確立了該方法的最佳反應(yīng)條件。其次,構(gòu)建相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,并以梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行絕對定量擴(kuò)增反應(yīng),結(jié)合CT 值和初始模板量成功繪制橫縱坐標(biāo)相關(guān)性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以此為基礎(chǔ)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除GoAstV出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S 型擴(kuò)增曲線外,其他水禽病毒均未發(fā)現(xiàn)明顯信號的特異性擴(kuò)增。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,CT 值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在每微升1.50×109拷貝至1.50×102拷貝之間呈良好的線性關(guān)系,102copies/μL 為熒光定量PCR 檢測方法的最小檢測模板濃度為。此方法批內(nèi)及批間實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性均比較好,其中批內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)小于0.5%,較前人建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法穩(wěn)定性更高。本方法為GoAstV 檢測提供了更多的選擇,為后期病毒在宿主體內(nèi)定植規(guī)律的研究和流行病學(xué)調(diào)查研究提供了技術(shù)支撐。

注:1-8:每微升1.50×109拷貝至1.50×102 拷貝;9:陰性對照。圖4 熒光定量PCR 敏感性實(shí)驗(yàn)Note.1-8, 1.50×109 copies/μL to 1.50×102 copies/μL.9, Negative control.Figure 4 Sensitive test of fluorescence quantitative PCR

表2 批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test results of intra-group and inter-group repeatability