陳換換張小莉桑曉林馮 龍于瑩瑩宋超杰李志慧

(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快,對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,病因與許多因素密切相關(guān),包括環(huán)境污染、吸煙、飲酒、職業(yè)因素等。肺癌的生物學(xué)特點(diǎn)為:侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、生長(zhǎng)速度快,預(yù)后效果差。大多數(shù)患者在確診時(shí)已發(fā)展至中晚期,多數(shù)已出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和局部侵犯。目前,抗腫瘤藥物層出不窮,但肺癌患者五年生存率未顯著增加。因此,尋找有效治療方案,提高肺癌患者生存質(zhì)量,是一個(gè)重要研究方向。越來越多的研究表明肺癌侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移的發(fā)生與microRNA(miRNA)密切相關(guān)。

miRNA 是長(zhǎng)度為18 ～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,通過與目的基因mRNA3’端結(jié)合進(jìn)而調(diào)控基因的蛋白表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、侵襲及凋亡的過程,參與疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。miR-373 位于染色體帶19q13.4 上,屬于miR-371-372-373 家族,其前體 pre-miR-373 經(jīng)過 Dicer 酶酶切后成為成熟的 miR-373-3p(又稱 miR-373) 和miR-373-5p,自然界絕大對(duì)數(shù)以 miR-373-3p 存在[2]。據(jù)報(bào)道[3],miRNAs 在人類癌癥中具有抑癌和致癌雙重作用。研究表明miR-373 在膽管癌[4]、鼻咽癌[5]、肝癌[6]、肺腺癌[7]中對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移和侵襲發(fā)揮重要調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道[8],miR-373 在肺癌A549 細(xì)胞中低表達(dá),過表達(dá)miR-373 可通過靶向TFIIB 相關(guān)因子2(BRF2)抑制A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

熊果酸(ursolil alid,UA)為五環(huán)三萜類化合物,可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9-12]。Chen 等[13]研究表明熊果酸可通過靶向miR-149-5p/MyD88 通路減弱非小細(xì)胞肺癌干性。李姝葉等[14]研究報(bào)道熊果酸可通過下調(diào)miRNA-21 作用于PTEN/PI3K/AKT 通路抑制肺癌A549 細(xì)胞遷移、增殖和侵襲。目前國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)熊果酸調(diào)控肺癌A549 細(xì)胞的凋亡和遷移與miR-373-3p 表達(dá)有關(guān)。本研究旨在觀察熊果酸是否通過調(diào)節(jié)miR-373-3p 影響肺癌A549細(xì)胞的凋亡和遷移,為肺癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

肺腺癌A549,購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑

熊果酸、化療藥物順鉑均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基RPMI-1640 以及 BCA 試劑盒,均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清,購(gòu)于德國(guó) BI 公司; miR-373-3p 模擬物(miR-373-3p mimics)、無關(guān)對(duì)照(miR-373-3p scramble)、下游靶蛋白TXNIP 引物序列,均由上海吉瑪公司合成;AnnexinⅤ- FITC/PI 雙染,凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)于美國(guó)BD 公司;TRIzol 試劑和脂質(zhì)體2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;TXNIP 和GAPDH 抗體均購(gòu)于Santa Cruz 公司。引物核苷酸序列見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌A549 細(xì)胞。將置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,每隔1 d 換 1 次液。A549 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約70%時(shí),用胰蛋白酶消化、傳代,用對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequence of primer

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h,把濃度為 0.5×105/mL 的 A549 細(xì)胞均勻鋪至6 孔板中,每孔加入2 mL RPMI-1640培養(yǎng)液;轉(zhuǎn)染當(dāng)日,細(xì)胞匯合度70%;根據(jù)Lip2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,用適量OptiMEM 無血清培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和mimics/scramble,室溫孵育5 min后混合,靜置20 min;將上述轉(zhuǎn)染混合液分別加入相應(yīng)6 孔板中;37℃,5% CO2繼續(xù)培養(yǎng) 4 ～6 h;更換RPMI-1640 完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力

將濃度為4×105/mL 的A549 細(xì)胞均勻鋪至96孔板中,每孔再補(bǔ)充100 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后,分別將 20、40、60、80、100 mol/L 熊果酸加入對(duì)應(yīng)96 孔板中,同濃度DMSO 溶劑作空白對(duì)照繼續(xù)培養(yǎng)24 h;MTT 法檢測(cè)時(shí),每孔加入20 μL 檢測(cè)試劑,避光孵育4 h;轉(zhuǎn)染miR-373-3p mimics 組和miR-373-3p scramble 組的檢測(cè)方法同上。檢測(cè)前,吸除每孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔再加入 100 μL MTT 試劑,測(cè)定每孔的 OD 值。每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 RT-PCR 檢測(cè) miR-373-3p 的表達(dá)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染加藥24 h 后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA;采用RT-PCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-373-3p 表達(dá)水平變化。首先,將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,并以cDNA 做為模板,U6 為反應(yīng)過程的內(nèi)參照,配制20 μL PCR 反應(yīng)體系,反應(yīng)步驟:96℃ 10 min,96℃ 20 s,60℃ 57 s,40 cycles。應(yīng)用 2-ΔΔCT方法計(jì)算 miR-373-3p 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量, ΔΔCT =(CTmiR-373-3p-CTU6)實(shí)驗(yàn)組-(CTmiR-373-3p-CTU6)對(duì)照組。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

肺癌A549 在不同濃度的熊果酸作用下和轉(zhuǎn)染miRNA-373 mimics、miRNA-373 scramble 的 A549 細(xì)胞24 h 后,分別收集各組細(xì)胞;用4℃ 預(yù)冷的PBS磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞 5 遍。參照 Annexin VFITC/PI 雙染試劑盒說明書:先用490 μL 緩沖液懸浮細(xì)胞,再加入 5 μL Annexin V-FITC 染液,混勻,避光染色15 min;再加入5 μL PI 染液,避光染色5 min。FCM 檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)凋亡蛋白TXNIP 表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染miR-373-3p mimics 后的細(xì)胞提取總蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合均勻,95℃,10 min 進(jìn)行蛋白變性;在10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠,200 V 電壓下進(jìn)行蛋白電泳;濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜,60 min;5%脫脂奶粉,1.5 h,封閉非特異性蛋白;TBST 緩沖液洗滌醋酸纖維素膜,洗滌 5 遍,每遍 10 min;加入TXNIP 一抗(1 ∶2000 稀釋),4℃ 過夜;TBST 洗滌 5次,每遍 10 min; HRP 二抗(1 ∶500 稀釋) 室溫孵育2 h;TBST 洗 5 次,每遍 15 min。ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影,Bio-Rad ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統(tǒng)掃描膠片。

1.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

以0.5×105的細(xì)胞數(shù)將肺癌A549 細(xì)胞接種于6 孔板中,當(dāng)細(xì)胞貼壁后,用10 μL 的小槍頭在6 孔板底劃痕,然后用PBS 清洗3 次,在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞拍照。然后將不同組別的細(xì)胞分別在24 h 和48 h 后繼續(xù)拍照。細(xì)胞劃痕愈合率(%)= (0 h 劃痕寬度- 24 h/48 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)齊性檢測(cè),對(duì)符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行描述;具備方差齊性時(shí)用單因素方差分析,當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的活力的抑制效果

熊果酸用DMSO 稀釋后,按照如下的濃度梯度作用于A549 細(xì)胞。MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示:與初始濃度 0 μg/mL 相比,熊果酸藥物濃度為 40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 時(shí),對(duì)肺癌 A549 細(xì)胞的抑制率明顯升高(P<0.001),IC50值為60 μmol/L。見圖1。

2.2 熊果酸能夠顯著升高A549 細(xì)胞中miRNA-373-3p 的表達(dá)

與轉(zhuǎn)染 miRNA-373-3p scramble 組相比, 轉(zhuǎn)染miRNA-373-3p mimic 后,A549 細(xì)胞中 miRNA-373-3p 表達(dá)顯著升高(P< 0.05)。說明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA-373-3p mimic 能夠明顯提高 A549 細(xì)胞中miRNA-373-3p mimic 的表達(dá)。將 60 μmol/L 的 UA作用于轉(zhuǎn)染miRNA-373-3p mimic 的A549 細(xì)胞,與單獨(dú) UA 組相比,24 h(16.787±3.109) 和 48 h(16.980±3.106),miRNA-373-3p 表達(dá)顯著升高(P<0.05)。說明UA 能夠使肺癌 A549 細(xì)胞內(nèi) miRNA-373-3p 的表達(dá)上調(diào)。見圖2。

2.3 miRNA-373-3p 促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)miR-373-3p mimic+熊果酸組(46.20±5.970),miR-373-3p mimic 組(37.50±4.069),熊果酸組(29.10±4.281)以及miRNA-373-3p scramble 組(13.90±3.520)中 A549 細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示:miR-373-3p mimic+UA,miR-373-3p mimic 組,UA 組細(xì)胞凋亡均明顯增加,并且與單獨(dú)使用 UA 組和轉(zhuǎn)染 miR-373-3p mimic 組相比,miR-373-3p mimic+UA 組細(xì)胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001)。見圖3。

注:與 0 μg/mL 組相比,???P<0.001。圖1 熊果酸作用24 h 對(duì)肺癌細(xì)胞A549 的抑制作用Note.Compared with 0 μg/mL group,??? P<0.001.Figure 1 Inhibitory effect of ursolic acid on lung cancer cell A549 for 24 h

注:A: miR-373-3p scramble 組;B: miR-373-3p mimic 組;C: UA組;D: miR-373-3pmimic+UA 組; 與 miR-373-3p scramble 組相比,?P<0.05;與 UA 組相比,?P<0.05。圖2 各組細(xì)胞中miRNA-373-3p 的表達(dá)Note.A, miR-373-3p scramble group.B, miR-373-3p mimic group.C, UA group.D, miR-373-3p mimic+UA group.Compared with miR-373-3p scramble group, ?P<0.05.Compared with UA group,?P<0.05.Figure 2 Expression of miRNA-373-3P in each group

2.4 miRNA-373-3p 能夠上調(diào)TXNIP 基因 mRNA和蛋白表達(dá)水平

與miR-373-3p scramble 組相比,miRNA-373-3p+UA 組,miRNA-373-3p 組以及 UA 組肺癌 A549 細(xì)胞中TXNIP 蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),TXNIP 基因 mRNA 表達(dá)也明顯升高(P<0.001)。提示:UA 可能通過調(diào)控miRNA-373-3p 的表達(dá),作用于肺癌A549 細(xì)胞,從而促進(jìn)凋亡蛋白相關(guān)基因TXNIP mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。見圖4,圖5,圖6。

2.5 miRNA-373-3p 抑制肺癌A549 細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 與 miR-373-3p scramble 組(65.12±3.29%)相比,UA 組(39.23±1.84%)、 miRNA-373-3p 組 (37.25 ± 3.31%) 和miRNA-373-3p+UA 組(34.33±2.08%)在 24 h 和 48 h 后,細(xì)胞劃痕愈合率有不同程度的降低。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果表明 miR-373-3p 能夠顯著抑制肺癌A549 細(xì)胞的遷移。見圖7。

3 討論

miR-373 在多種腫瘤中均檢測(cè)到異常表達(dá),為癌基因或抑癌基因,影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué),可作為腫瘤早期診斷、治療靶點(diǎn)或預(yù)后監(jiān)測(cè)的指標(biāo)[15]。有研究[16]表明miR-373 在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤作用,通過抑制Ras 相關(guān)蛋白R(shí)ab22a(一種癌蛋白)的表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Huang 等[2]研究發(fā)現(xiàn)miR-373 在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào),通過下調(diào)靶基因膜相關(guān)環(huán)指蛋白5 抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Adi 等[17]發(fā)現(xiàn)miR-373 在肺腺癌組織中表達(dá)下調(diào),但具體分子機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-373-3p 在肺癌A549 細(xì)胞中低表達(dá),通過流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miRNA-373 mimics 的A549 細(xì)胞及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-373-3p 可促進(jìn)肺癌A549 細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移,基于此,我們分析miR-373-3p 可能對(duì)肺癌A549 細(xì)胞的遷移、凋亡有一定調(diào)控作用。

熊果酸具有多種生物活性,如具有保肝、抗炎、抗腫瘤等[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)[14]熊果酸通過下調(diào)PTEN/PI3K/AKT 通路下 miRNA-21 的表達(dá),抑制肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。最新研究表明[13],熊果酸通過抑制miR-149-5p / MyD88 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低A549 細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可抑制肺癌A549 細(xì)胞活力,顯著提高A549 細(xì)胞中 miR-373-3p 的表達(dá),此外,與單獨(dú)熊果酸組和miRNA-373-3p mimic 組比,熊果酸作用于轉(zhuǎn)染 miRNA-373-3p mimic 的 A549 細(xì)胞中miRNA-373-3p 表達(dá)較高,由此我們推測(cè)熊果酸可能通過調(diào)控miRNA 分子促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡并抑制其遷移。

注:1:miRNA-373-3p+UA 組;2:miR-373-3p scramble 組;3:UA組;4:miRNA-373-3p 組。圖4 miRNA-373-3p 對(duì)肺癌細(xì)胞A549 內(nèi)凋亡蛋白TXNIP 的表達(dá)Note.1, miRNA-373-3p+UA group.2, miR-373-3p scramble group.3, UA group.4, miRNA-373-3p group.Figure 4 Expression of the apoptotic protein TXNIP in lung cancer cell A549 by miRNA-373-3P

注:A:miRNA-373-3p+UA 組;B:miR-373-3p scramble 組;C:UA 組;D:miRNA-373-3p 組。與 miR-373-3p scramble 組相比,?P<0.05。圖5 miRNA-373-3p 對(duì)肺癌細(xì)胞A549 TXNIP 蛋白表達(dá)量的影響Note.A, miRNA-373-3p + UA group.B, miR-373-3p scramble group.C, UA group.D, miRNA-373-3p group.Compared with miR-373-3p scramble group, ?P<0.05.Figure 5 Effect of miRNA-373-3P on the expression of A549 TXNIP protein in lung cancer cells

注:A:miR-373-3p scramble 組;B:miR-373-3p mimic 組;C:UA 組;D:miR-373-3pmimic+UA 組。與 miR-373-3p scramble 組相比,???P<0.001。圖6 TXNIP mRNA 表達(dá)的比較Note.A, miR-373-3p scramble group.B, miR-373-3p mimic group.C, UA group.D, miR-373-3p mimic+UA group.Compared with miR-373-3p scramble group,???P<0.001.Figure 6 Comparison of TXNIP mRNA expression

研究表明硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP,thioredoxin-interacting protein)在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá),而且研究發(fā)現(xiàn)TXNIP 是潛在的抑癌基因[21],但其抑癌機(jī)制尚不明確。Chen 等[22]研究表明TXNIP 是miR-373 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的靶基因,miR-373 通過miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。研究表明[23]組蛋白脫乙?；敢种苿㎡BP-801 可誘導(dǎo)TXNIP 的蛋白表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本課題在肺癌A549 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-373-3p 的模擬物,Real-time PCR 結(jié)果顯示,肺癌A549 細(xì)胞miR-373-3p 表達(dá)量顯著升高。經(jīng)熊果酸作用后,Real-time PCR 結(jié)果顯示TXNIP 的表達(dá)亦顯著升高。因此,推測(cè)熊果酸可能通過促進(jìn)miR-373-3p 誘導(dǎo) TXNIP 的表達(dá),從而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述,本課題初步研究顯示熊果酸顯著促進(jìn)肺癌 A549 細(xì)胞凋亡并且抑制細(xì)胞遷移,其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)miR-373-3p 表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲,為熊果酸應(yīng)用于肺癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

注:A:UA 組;B:miRNA-373-3p 組;C:miRNA-373-3p+UA 組;D:miR-373-3p scramble 組。圖7 miRNA-373-3p 抑制肺癌A549 細(xì)胞的遷移Note.A, UA group.B, miRNA-373-3p group.C, miRNA-373-3p+UA group.D, miR-373-3p scramble group.Figure 7 miRNA-373-3p inhibits the migration of lung cancer A549 cells