梁玉瓊黃 慶梁天堅汪 磊覃日宏盤 涌滕麗娟羅彩神

(1.廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院實驗中心,南寧 530222; 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部,南寧 530023; 3.廣西壯瑤藥技術研究中心,南寧 530200)

薯蕷皂苷是一種天然甾體皂苷,廣泛存在于豆科、薯蕷科、百合科等多種藥用植物,是某些中藥復方的主要活性成分,如維奧欣片、地奧心血康、穿龍刺骨片。藥理研究表明,薯蕷皂苷具有多種生物活性,包括抗腫瘤、抗真菌、調(diào)節(jié)免疫、抗血小板聚集、改善心血管作用等[1-2]。有趣的是,近年來越來越多研究報道稱,薯蕷皂苷對多種癌細胞具有抗癌作用,如人類白血病 K562、人類肺癌 A549 和肝癌Huh7、HepG2[3-4]。但是,薯蕷皂苷對 Bel-7402 肝癌細胞的影響及機制尚未闡明。另外,臨床使用發(fā)現(xiàn),長期口服薯蕷皂苷片,患者肝功能指標ALT 及AST 倍增,停藥并均給予益肝靈、聯(lián)苯雙酯降肝酶及注射還原型谷胱甘肽護肝治療(36±8)d 后,肝酶恢復正常,提示長期使用薯蕷皂苷片可能導致肝功能損傷[5]。本課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn),中藥黃藥子總皂苷中的主要成分薯蕷皂苷也對正常大小鼠肝具有損害作用[6-7]。因此,薯蕷皂苷被認為是一把“雙刃劍”,其在發(fā)揮抗肝癌作用的用時,亦對肝細胞具有一定的毒性作用,這應引起我們的關注。本研究擬選用肝癌細胞 Bel-7402 和正常人肝細胞LO2,比較相同給藥時間和相同給藥劑量條件下薯蕷皂苷對這兩種細胞增殖和凋亡的影響及可能機制,為開發(fā)其抗肝癌作用和臨床安全合理用藥提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

正常人肝細胞LO2 由廣西中醫(yī)藥大學中藥藥效研究重點實驗室謝金玲惠贈,人肝癌細胞Bel-7402 購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

薯蕷皂苷(純度≧98%),白色粉末結(jié)晶,批號:Y06D9Z76750,上海源葉科技有限公司提供。二甲基亞砜(DMSO)完全溶解薯蕷皂苷后,0.22 μm 濾器過濾除菌,配制薯蕷皂苷母液濃度為20 μmol/L,-20℃保存。實驗前取薯蕷皂苷母液加入DMEM 單培配制成所需濃度。胎牛血清(批號:1912660C)、DMEM 培養(yǎng)基(批號:8115119)、RPMI1640 培養(yǎng)基(批號:8119071),均購自美國GIBCO 公司;胰蛋白酶-EDTA 消化液(批號:20190430)、MTT(批號:M8180),均購自北京Solarbio 公司;Hoechst33258 染色液(批號:C0003-2)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(批號:040319190715),均購自碧云天生物技術研究所;RIPA Lysis Buffer(批號:3E083E08)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(批號:08E02A46),購自武漢博士德生物技術有限公司;β-actin mouse monoclonal antiby (批 號: 1619501)、 BAX Rabbit PolyAb(批號:50599-2-1 g)、BCL-2 Rabbit PolyAb(批號:12789-1-AP)、goat anti-rabbit IgG(批號:SA00001- 2) 及 Anti-Mouse IgG(H +L) (批號:SA00001-2),均購自美國 Proteintech 公司;ECL 發(fā)光液(批號:OC183596),購自美國 thermo 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

倒置顯微鏡(TS100,日本Nikon);倒置相差熒光顯微鏡(日本 Nikon);電子天平(千分之一)(BSA423S-CW,德國賽多利斯科學儀器有限公司);離心機(LDZ5-2,北京醫(yī)用離心機廠);高速冷凍離心機(ALLEGRA X-15R,美國貝克曼);CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150,德國Thermo);低溫冰箱(HYCD-282,Haier Bio-MEDICAL);BioTek 酶標儀,(美國BioTek 公司);電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);-80℃冰箱(美國 Thermo 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

LO2 肝細胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)皿的80%后,用0.25%胰蛋白酶消化并傳代繼續(xù)培養(yǎng),并取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的LO2 肝細胞進行實驗。同樣的方法處理和培養(yǎng)Bel-7402 肝癌細胞,注意選用含有10%濃度的滅活胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液。

1.3.2 MTT 法檢測薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞增殖能力的影響

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Bel-7402 肝癌細胞,0.25%胰酶消化,收集細胞,調(diào)整細胞密度至每毫升 3×104個,按每孔 200 μL 接種于 96 孔板,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后,吸棄培養(yǎng)基,各孔加入適量已預溫至37℃的PBS 以除去死細胞,再加入薯蕷皂苷使其終濃度為0.5,1,2,4,6,8,10,16 μmol/L,并設不加藥的陰性對照組。每組設6 個復孔,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,去除培養(yǎng)基,每孔加入 10 μL MTT(5 mg/mL,PBS 配制),37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育結(jié)束后,吸棄 MTT 上清。每孔加入 200 μL 二甲基亞砜,水平搖床上搖勻10 min 以使甲瓚充分溶解,酶標儀于波長490 nm 測定吸光度A。同樣的方法處理LO2 肝細胞。細胞活力=(藥物組平均A-調(diào)零孔A)÷(對照組平均A-調(diào)零孔A)×100%。

1.3.3 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞形態(tài)學的影響

取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Bel-7402 肝癌細胞,0.25%胰酶消化,收集細胞,調(diào)整細胞密度至每毫升1.0×104個,按每孔2 mL 接種于6 孔板中。孵育24 h 后分別以含0,1,2 μmol/L 薯蕷皂苷處理細胞,每組設3 個復孔,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。給藥24 h 后,倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況,并拍照記錄細胞形態(tài)變化。同樣的方法處理LO2 肝細胞。

1.3.4 Hoechst33258 染色觀察細胞凋亡

同1.3.3 對Bel-7402 肝癌細胞進行處理,孵育24 h 后,待細胞貼壁后,各孔加入適量已預溫至37℃的 PBS 以除去死細胞,給藥組加入含 1,2 μmol/L 薯蕷皂苷處理細胞,陰性對照組加入等量無血清培養(yǎng)液,每組設3 個復孔,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后,吸棄培養(yǎng)液,用 PBS 洗兩次,每次10 min,吸棄液體,每孔加入500 μL 固定液,固定20 min。去除固定液,用PBS 洗兩次,每次5 min,每孔加入500 μL Hoechst33258 染色液,手動晃動染色5 min,吸棄,用PBS 洗三次,每次5 min。每孔滴適量抗熒光淬滅封片液,使用熒光倒置顯微鏡觀察。同樣的方法處理LO2 肝細胞。

1.3.5 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞線粒體膜電位的影響

取對數(shù)生長期Bel-7402 肝癌細胞接種于6 孔板上,細胞分組及干預同1.3.3。按照試劑盒說明書對線粒體膜電位進行檢測。干預24 h 后的Bel-7402 肝癌細胞經(jīng)消化離心收集后,重懸于0.5 mL RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中,加入0.5 mL JC-1 染色工作液,混勻后置于37℃孵育20 min。孵育結(jié)束后,5000 r/min 4℃離心4 min,棄上清,細胞用預先冰浴JC-1 染色緩沖液(1X)洗滌2 次,重懸后使用熒光分光光度計檢測。以紅綠熒光相對比值作為衡量線粒體去極化程度。同樣的方法處理LO2 肝細胞。

1.3.6 Western blot 蛋白質(zhì)印跡法檢測Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞Bcl-2、Bax 蛋白表達

同1.3.3 對Bel-7402 肝癌細胞進行處理,孵育24 h 后分別以含1,2 μmol/L 薯蕷皂苷處理細胞,同時設不加藥的陰性對照組,每組設6 個復孔,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。薯蕷皂苷干預24 h 后,吸棄培養(yǎng)液,再使用PBS 洗滌培養(yǎng)板中的細胞,每次平放輕輕搖動1 min 以洗滌細胞,棄去洗滌液。重復以上操作兩次,將PBS 洗凈的培養(yǎng)皿置于冰上。加入300 μL 含 PMSF 的 RIPA,搖勻置于冰上,使用干凈的刮棒快速將細胞刮下,然后收集刮下的細胞碎片和裂解液。最后,將收集的脫落細胞裂解液與培養(yǎng)皿中裂解液混合,于 4℃下 12000 r/min 離心 10 min,取適量上清按照BCA 蛋白濃度試劑盒說明書檢測蛋白濃度,其余加等體積的加樣緩沖液,置于水浴鍋中100℃變性15 min,所得的蛋白置于-80℃保存待測。

按照實驗室前期所用檢測方法測定Bel-7402肝癌細胞中 Bcl-2 及Bax 蛋白表達[8]:取20 μg 蛋白上樣,電泳40 mA 1.5 h,轉(zhuǎn)膜100 V 1.5 h,將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF 上。5%脫脂奶粉封閉2 h,1×TBST 洗膜 10 min×3 次。加入一抗(Bcl-2 兔抗血清,1 ∶2000;Bax 兔抗血清,1 ∶2000;β-actin 羊抗血清為內(nèi)參照,1 ∶2000)4℃孵育過夜后,移去一抗,1×TBST 洗膜 10 min×3 次。加入二抗(1 ∶2000)室溫孵育 1.5 h,移去二抗,1×TBST 洗膜 10 min×3 次后,將PVDF 膜放入Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行ECL 顯影。用Image J 軟件分析各組平均條帶積分吸光度。

同樣的方法處理LO2 肝細胞。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有實驗重復≥3 次,結(jié)果取3 次平均值,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差( _x ± s)表示。采用 SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞增殖能力的比較

MTT 法檢測結(jié)果顯示,與各自陰性對照組比較,薯蕷皂苷作用于Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞24 h 后,可表現(xiàn)出顯著的細胞增殖抑制作用,呈劑量依賴性;但在同一濃度下,薯蕷皂苷對兩種細胞的增殖抑制能力沒有顯著差異。其中Bel-7402肝癌細胞的 IC50 為 2.04 μmol/L,LO2 肝細胞的IC50 為 2.76 μmol/L, 因 此 本 實 驗 后 期 選 擇1 μmol/L、2 μmol/L 薯蕷皂苷干預 Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞,觀察其對這兩種細胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果見圖1。

2.2 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞形態(tài)影響的比較

倒置顯微鏡觀察顯示,陰性對照組細胞呈不規(guī)則多邊形、細胞間分界清晰、表面光滑;1 μmol/L 薯蕷皂苷處理24 h 后,Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞分布密度稍微降低,偶見少數(shù)細胞變圓脫落死亡,細胞邊界模糊;而在2 μmol/L 薯蕷皂苷濃度下,兩種細胞分布密度顯著降低,大量細胞出現(xiàn)變圓、皺縮,結(jié)果見圖2。

2.3 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞凋亡形態(tài)學影響的比較

熒光染色顯示,陰性對照組未發(fā)生凋亡,細胞形態(tài)完整,細胞核染色均勻,呈低強度藍色熒光,未見致密濃染、核膜破裂。與陰性對照組比較,1 μmol/L 薯蕷皂苷干預Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞后細胞發(fā)生凋亡,細胞核染色質(zhì)呈致密濃染,細胞核膜破裂,發(fā)出藍色熒光;而2 μmol/L 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞的促凋亡作用高于LO2 肝細胞,結(jié)果見圖3。

2.4 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞線粒體膜電位影響的比較

JC-1 染色后,當線粒體膜電位水平較高時發(fā)出紅色熒光,當線粒體膜電位水平下降較低時發(fā)出綠色熒光。與各自陰性對照組比較,1、2 μmol/L 薯蕷皂苷干預Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞24 h 后,紅色熒光減少綠色熒光增多,紅色熒光/綠色熒光比例下降,說明線粒體膜電位水平均顯著降低(P<0.01),且呈濃度依賴效應。說明薯蕷皂苷可降低Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞的線粒體膜電位,結(jié)果見圖4。

2.5 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響

實驗結(jié)果顯示,1、2 μmol/L 薯蕷皂苷作用Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞后,均可抑制兩種細胞中Bcl-2 蛋白的表達,上調(diào)Bax 蛋白的表達;但薯蕷皂苷抑制Bel-7402 肝癌細胞Bcl-2 及升高Bax 蛋白表達的作用均高于同濃度薯蕷皂苷作用于LO2 肝細胞,且呈劑量相關性,結(jié)果見圖5。

圖1 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2肝細胞增殖的抑制作用( ±s,n=6)Figure 1 Inhibitory effect induced by dioscin in Bel-7402 and LO2 cells

注:箭頭指示代表損傷細胞。圖2 薯蕷皂苷對細胞形態(tài)的影響Note.Arrows represent injured cells.Figure 2 Morphological changes induced by dioscin in Bel-7402 and LO2 cells

3 討論

肝癌惡性程度高,發(fā)病隱匿,其病死率是占據(jù)世界第3 位、我國第2 位的惡性腫瘤[9]。肝癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為制約患者長期生存的瓶頸。究其原因,在于肝癌的發(fā)病機制尚未明確,各種治療方法均未切中其“要害”。因此,探求肝癌的發(fā)病機制,對于肝癌的診斷、預防及提高生存率具有重要現(xiàn)實意義。

注:箭頭指示代表凋亡細胞。圖3 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞凋亡形態(tài)的影響Note.Arrows represent apoptotic cells.Figure 3 Effect of apoptosis features induced by various doses of dioscin in Bel-7402 and LO2 cells stained with Hoechst 33258

注:與陰性對照組比較,??P<0.01。圖4 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2肝細胞線粒體膜電位影響( ±s,n=3)Note.Compared with the negative control group,??P<0.01.Figure 4 Effect of mitochondrial membrane potential induced by various doses of dioscin in Bel-7402 and LO2 cell

薯蕷皂苷既有抗肝癌作用,也是一種致肝毒性的成分,其毒-效差異仍有待深入探討。本文以薯蕷皂苷為研究對象,比較0,1,2 μmol/L 薯蕷皂苷在24 h 內(nèi)對Bel-7402 肝癌細胞和LO2 正常人肝細胞的增殖抑制及凋亡作用。實驗結(jié)果顯示,薯蕷皂苷能夠明顯抑制Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞的增殖,但在同一給藥濃度下,薯蕷皂苷對Bel-7402肝癌細胞的抑制率均高于LO2 肝細胞。Hoechst 染色結(jié)果顯示,1 μmol/L 薯蕷皂苷干預24 h 后,兩種細胞數(shù)量逐漸減少、變圓,且當薯蕷皂苷劑量達到2 μmol/L 時,大量細胞死亡。細胞凋亡是導致細胞死亡的重要途徑之一,凋亡異常也是腫瘤誘發(fā)的關鍵因素。故應用Hoechst33258 熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷干預Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞后細胞發(fā)生凋亡,細胞核染色質(zhì)呈致密濃染,細胞核膜破裂,發(fā)出藍色熒光,但2 μmol/L 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞的促凋亡作用高于LO2 肝細胞。以上結(jié)果說明,薯蕷皂苷可抑制Bel-7402 肝癌細胞和LO2 肝細胞增殖并誘導凋亡,提示薯蕷皂苷作為抗肝癌候選藥物的同時,亦表現(xiàn)出一定的肝細胞損傷作用。因此,由于薯蕷皂苷潛在的肝毒性作用,臨床應用相關藥物時應注意監(jiān)測肝功能變化,并避免長期、超劑量用藥。

注:A:Bel-7402 肝癌細胞蛋白表達條帶;B:Bel-7402 肝癌細胞內(nèi)各蛋白相對表達量;C:LO2 肝細胞蛋白表達條帶;D:LO2 肝細胞內(nèi)各蛋白相對表達量。與陰性對照組比較 ?P <0.05,??P<0.01。圖5 薯蕷皂苷對Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響( _x ± s,n=6)Note.A, Protein expression band of Bcl-2,Bax in Bel-7402 cells.B, Relative protein expression of Bcl-2, Bax in Bel-7402 cells.C,Protein expression band of Bcl-2, Bax in LO2 cells.D, Relative protein expression of Bcl-2,Bax in LO2 cells.Compared with the negative control group, ?P<0.05, ??P<0.01.Figure 5 Effect of dioscin on protein expression of Bcl-2,Bax in Bel-7402 and LO2 cells

臨床報道,高血壓患者常規(guī)口服薯蕷皂苷片(80 mg,每天3 次)三個半月后,即總服用劑量達25.2 g,出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高,停用一個多月后,ALT、AST 恢復正常[5]。另有研究證實,小鼠連續(xù)尾靜脈注射給予10 mg/kg 薯蕷皂苷7 d 后,血清AST、LDH升高,肝細胞水腫并偶見巨核肝細胞現(xiàn)象[10]。上述研究結(jié)果與本文研究結(jié)果一致,均證明薯蕷皂苷具有潛在的肝毒性作用。因此,臨床使用含薯蕷皂苷相關藥物(如維奧欣)時,應注意監(jiān)測肝功能變化,并避免長期、超劑量用藥,建議薯蕷皂苷口服用藥劑量累計應低于25.2 g。

線粒體膜電位下降是細胞凋亡的早期標志,線粒體膜電位隨著細胞凋亡程度的加深而降低甚至消失。JC-1 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與各自陰性對照組比較,1、2 μmol/L 薯蕷皂苷干預 Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞24 h 后,線粒體膜電位水平均顯著降低,且呈濃度依賴效應。與此同時,細胞凋亡是一種程序性死亡過程,它已經(jīng)在各種疾病,包括肝癌中顯現(xiàn)出它的重要性[11]。Bcl-2 是一種細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子[12-13]。Bax 是Bcl-2 家族中促進細胞凋亡的因子,編碼的Bax 能夠與Bcl-2 形成異二聚體,阻抑Bcl-2 蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2/Bax 蛋白的比值對細胞凋亡的抑制起關鍵性作用[14]。Western blot 結(jié)果顯示,隨著薯蕷皂苷給藥濃度從1 μmol/L增加至2 μmol/L,Bel-7402 肝癌細胞及LO2 肝細胞中的Bcl-2 蛋白表達下降,Bax 蛋白表達均升高。

綜上所述,薯蕷皂苷能抑制Bel-7402 肝癌細胞和LO2 肝細胞的體外增殖,降低線粒體膜電位,上調(diào)Bax 蛋白的表達、抑制低Bcl-2 蛋白的表達,可初步推斷其機制可能是通過線粒體途徑降低線粒體膜電位,抑制 Bcl-2 蛋白表達,上調(diào) Bax 蛋白的表達,從而誘導細胞發(fā)生凋亡。同時,也提示薯蕷皂苷在發(fā)揮抗肝癌作用的同時亦對肝細胞具有損傷作用。目前本研究僅從體外細胞實驗探討薯蕷皂苷的抗肝癌及肝毒性作用,故為保證薯蕷皂苷的開發(fā)應用,還需從動物實驗研究其“量-效”、“毒-效”差異關系及分子機制。