劉月環(huán)么春艷吳舊生

(1.杭州醫(yī)學院(浙江省醫(yī)學科學院),杭州 310013; 2.浙江大學,杭州 310058)

Pnpla3 ( patatin-like phospholipase domaincontaining 3,patatin 樣磷脂酶域蛋白3,又叫做甘油酯O-酰基轉(zhuǎn)移酶,即脂肪滋養(yǎng)蛋白adiponectin),能夠通過將溶血磷脂酸轉(zhuǎn)化磷脂酸促進細胞脂質(zhì)合成,同時具有水解脂肪酶和轉(zhuǎn)移?；傅幕钚訹1]。Pnpla3 在代謝相關組織(如脂肪、腎上腺和肝)中高表達,且低纖維高碳水化合物飲食很容易引起其表達的下調(diào)。Pnpla3 基因在人群中具有多態(tài)性,這個多態(tài)性可能引起肝脂肪沉著和炎癥[2]。然而目前對于Pnpla3 基因多態(tài)性影響非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病與脂代謝的具體分子機制還不清楚,有些研究結(jié)果還互相矛盾,如通過RNAi 機制沉默Pnpla3 基因以及在小鼠中敲除Pnpla3 并沒有影響甘油三酯的水解,也未能獲得脂肪肝表型[3]。將Pnpla3(I148 M)通過腺病毒載體或GalNAc(三價N-乙酰半乳糖胺)-siRNA 感染小鼠肝,能影響甘油三酯的降解水平并增加肝中脂肪的積累[4-5]。目前認為小鼠缺失野生型Pnpla3 基因并不會引起脂肪肝,而敲入人的148 M 等位基因小鼠會出現(xiàn)肝脂肪堆積[6-7],這提示Pnpla3 基因及其多態(tài)性在NAFLD 中的作用機制比人們想象的要復雜,其作用靶器官和生理機制也不完全清楚,因此為配合Pnpla3 基因功能的研究,可以考慮擴大模型的范圍和種類。

筆者通過多年的研究發(fā)現(xiàn),長爪沙鼠活體模型與人類NAFLD 特征相似(病理譜包括了單純脂肪肝,脂肪性肝炎,肝纖維化,肝硬化四個階段),具有病程持續(xù)進展的可控性且成模時間短等優(yōu)勢[8],從而為NAFLD 的研究增添了一個選擇。目前該動物模型已形成了一套固定的造模方法,然而由于NAFLD 領域的快速發(fā)展、相關藥物篩選又對體外模型產(chǎn)生了迫切的需要,為此我們在前期分離培養(yǎng)長爪沙鼠肝實質(zhì)細胞的基礎上[9],用棕櫚酸(PA)誘導原代肝細胞形成肝脂變模型(對應于活體的脂肪肝階段),并用其對自行分離制備的化合物靈芝三萜酸(GLTA)的降脂效果進行了觀察。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級3 月齡雄性長爪沙鼠3 只,體重 50 ～70 g,購自浙江省實驗動物中心[SCXK(浙)2019-0002],動物飼養(yǎng)于浙江省實驗動物中心(杭州醫(yī)學院實驗動物中心)[SYXK(浙)2019-0011],經(jīng)本單位實驗動物倫理委員會批準同意(2018-094),并滿足動物實驗中的3R 要求),用于分離培養(yǎng)肝實質(zhì)細胞。

1.2 主要試劑與儀器

陽性藥物蛋氨酸的工作濃度為1 mg/mL(7 μmol/L),自行制備的靈芝三萜酸 GLTA(專利ZL201510933865.8),三個劑量的工作濃度分別是0.01 μmol/L,0.1 μmol/L,1 μmol/L。DMEM 培養(yǎng)基(Hyclone,貨號SH30243.01);胎牛血清(四季青,11011 - 8611); Trypsin 0.25% ( 1 ×) Solution( Hyclone, SH30042.01 )、 Lipofectamine2000(invitrogen,貨號 11668-027)、SYBR Green qPCR 試劑盒(康為世紀,貨號CW2601);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀,貨號 CW2569);GAPDH 及 Western blot 相關二抗(華安生物,60004-1-1 g);Pnpla3 抗體(affinity,貨號 DF2942)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兩步灌流法分離培養(yǎng)沙鼠肝原代實質(zhì)細胞

長爪沙鼠經(jīng)CO2麻醉、消毒后固定于操作臺,打開腹腔,暴露門靜脈。用眼科鑷輕輕剝離門靜脈周圍系膜,在游離的門靜脈處插入靜脈留置針,用動脈夾固定。剪開下腔靜脈,先用無鈣灌流液開放灌流至肝呈土黃色,再用含鈣的0.025%膠原酶液灌流至肝柔軟塌陷、壓之留痕。分離肝,用含5%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化反應,用眼科鑷和眼科剪輕柔撕開肝被膜、抖落肝細胞。之后分別用100 目、200 目鋼篩過濾,收集肝細胞濾液,室溫靜置15 min 后棄上清,加入含5%新生牛血清的HBSS 洗滌肝,反復離心洗滌4 次備用。

1.3.2Pnpla3 siRNA 篩選

(1)Pnpla3 siRNA 載體設計、合成

siRNA 干擾的基因參考序列為 Gene ID:110545027,主要針對三個外顯子進行干擾RNA 引物設計,從三個載體中篩選出一個干擾效率高的載體作為后續(xù)實驗用siRNA。實驗操作時分為空白組、siRNA 對照組、siRNA 1 組、siRNA 2 組、siRNA 3組,結(jié)果判斷以相對于對照組來說,PA 造模24 h 脂滴含量最少,Pnpla3 表達量最低(mRNA 表達水平顯著降低(P<0.05 或P<0.01),干擾效率高于70%)為準。引物設計及合成由上海吉瑪公司完成,序列如下,詳見表1。

(2)siRNA 轉(zhuǎn)染沙鼠肝細胞

取生長狀態(tài)良好的長爪沙鼠肝原代實質(zhì)細胞,以 5×105/孔接種到 12 孔板中,37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱24 h→每一管siRNA 中加入125 μL DEPC水配置成20 μmol/L→用50 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋siRNA 為 100 nmol/L 混勻;用 50 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋1 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體混勻后室溫下靜置50 min→混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA 稀釋液,混勻后室溫下靜置20 min→轉(zhuǎn)染復合物加入12 孔板中,前后輕搖細胞板混合均勻→轉(zhuǎn)染后,培養(yǎng)4～6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基→繼續(xù)培養(yǎng)至18～48 h后,收取各組的細胞沉淀。在檢測出最佳Pnpla3 最佳干擾siRNA 后,以48 h 為最大轉(zhuǎn)染時間,每樣三個重復。

(3)QPCR

取培養(yǎng)細胞1000 r/min 離心5 min 棄上清收集管底細胞抽提RNA 后立即進入反轉(zhuǎn)錄階段,反轉(zhuǎn)錄反應總體積為 20 μL,包括 4 μL 的 dNTP Mix(2.5 mmol/L Each),引物混合物2 μL,5×RT Buffer 4 μL,DTT(0.1 mol/L)2 μL,HiFiScript(200 U/ μL)1 μL,RNA 模板 1 μL,雙蒸水(RNase Free)6 μL。反應條件:42℃,15 min;85℃,5 min。反應結(jié)束后產(chǎn)物作為cDNA 模板進入 QPCR 階段。qRT-PCR 所用引物序列(Gene ID: 110545027)信息如表2。

實時熒光定量PCR 反應總體積20 μL,其中包括 2×UltraSYBR Mixture (Low ROX) 10 μL,PCR Forward Primer (10 μmol/L) 1 μL, PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 1 μL,cDNA 模板 2 μL,雙蒸水(RNase Free)6 μL。用漩渦振蕩器將管中溶液徹底混合均勻,短暫低速離心。反應條件:95℃,10 min變性;95℃,15 s;60℃,60 s;40 個循環(huán),每樣三個重復。反應結(jié)束后收集數(shù)據(jù)計算轉(zhuǎn)錄水平的表達量(2-ΔΔCt方法)。

(4)Western blot

收集細胞1000 r/min 離心5 min 棄上清→600 μL 的RIPA 裂解液(含PMSF 和蛋白酶抑制劑)冰上勻漿裂解30 min→離心管12000 r/min 4℃離心5 min→取上清測濃度并標準化→ Loading buffer(β-巰基乙醇=50 ∶3)(體積比為 Loading buffer:樣品=1∶4),沸水煮 5 min 變性→室溫冷卻-20℃→SDSPAGE 電泳(濃縮膠5%,分離膠10%)后轉(zhuǎn) PVDF膜,經(jīng)過封閉→TBST 洗3 次→一抗過夜→TBST 洗3 次→二抗→TBST 洗3 次→ECL 法顯影定影→拍照分析。

表1 Pnpla3 siRNA 的引物序列Table 1 Primer sequence of Pnpla3 siRNA

表2 Pnpla3 基因引物序列Table 2 Primers sequence of Pnpla3 gene

1.3.3 棕櫚酸PA 誘導的長爪沙鼠肝脂變模型的建立

使用自行配制的PA,母液為10 mmol/L,取對數(shù)生長期沙鼠肝細胞接種于6 孔板中,每孔共3×105個細胞,每孔2 mL 培養(yǎng)基含PA 的終濃度梯度設定為 100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L,每個濃度3 個重復。時間到后棄去培養(yǎng)基,用PBS 輕柔清洗1 次,4%多聚甲醛固定15 min;吸棄多聚甲醛,PBS 清洗1 次,60%異丙醇潤洗3 min,PBS 清洗1 次,加入油紅O 工作液染色過夜,用蒸餾水洗2 次,風干后光學顯微鏡觀察拍照,誘導分為12 h,24 h 兩個時間點,產(chǎn)生的脂滴較多且細胞形態(tài)正常者為最佳的造模濃度。

1.3.4 靈芝三萜酸(GLTA)對敲減(干擾)Pnpla3后的肝細胞內(nèi)TG 的影響

將細胞接種入12 孔板,分為十組,分別是A:空白對照組;B:肝細胞+PA 組;C:肝細胞+PA+siRNA組;D:肝細胞+PA+藥物低劑量組;E:肝細胞+PA+藥物低劑量組+siRNA 組;F:肝細胞+PA+藥物中劑量組;G:肝細胞+PA+藥物中劑量組+siRNA 組;H:肝細胞+PA+藥物高劑量組;I:肝細胞+PA+藥物高劑量組+siRNA 組;J:肝細胞+PA+陽性藥物蛋氨酸組,每組三個重復。將細胞懸液過濾,3500 r/min 離心15 min,取上清液,-20℃保存,48 h 內(nèi)采用全自動生化分析儀測定細胞上清液的TG 含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。組間兩兩比較,方差齊性者采用兩獨立樣本t檢驗,方差不齊者采用Kruskal-WallisH檢驗,同時用Graphpad prism5.0 軟件進行統(tǒng)計學分析校驗及作圖。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 篩選的結(jié)果

2.1.1 PA 濃度的篩選

因肝實質(zhì)細胞體外培養(yǎng)時具有有限的旺盛期,綜合考慮Pnpla3 基因干擾的時間和藥物作用時間,造模時間為PA 誘導后12～24 h,隨著PA 給藥濃度的增加及造模時間延長,沙鼠肝細胞內(nèi)可見脂質(zhì)沉積增多,細胞輪廓變圓,細胞間結(jié)合緊密度下降,結(jié)果見圖1。因此選所以選擇誘導24 h 內(nèi),細胞脂滴增加的較多且大多數(shù)細胞形狀正常的PA 200 μmol/L,PA 400 μmol/L 均為合適的工作濃度。

2.1.2Pnpla3 siRNA 干擾對沙鼠肝細胞脂肪沉積的影響

siRNA 干擾Pnpla3 基因48 h 后,對長爪沙鼠肝實質(zhì)細胞進行油紅染色和形態(tài)學觀察,結(jié)果見圖2,對照組細胞內(nèi)可見較多脂質(zhì)沉積,以小脂滴沉積為主,PA 濃度定為400 μmol/L 為干擾后造模的合適工作濃度,并以此濃度造模,每組重復3 孔,進行藥物效果試驗。

2.1.3 干擾Pnpla3 基因后qPCR 結(jié)果

由圖3 可以看出,三組干擾載體轉(zhuǎn)染后Pnpla3基因表達量的QPCR 的結(jié)果表明,與空白組相比,siRNA2 組表達量最低(P<0.01),其次是siRNA3組(P<0.05),siRNA1 沒有差異(P>0.05)因此,siRNA2 組為最佳干擾載體。

2.1.4 干擾Pnpla3 基因后Western blot 結(jié)果

根據(jù)圖3 和圖4 可得,與空白組相比,siRNA 對照組沙鼠肝細胞Pnpla3 蛋白表達水平和mRNA 表達水平無顯著變化(P>0.05),Pnpla3 siRNA 轉(zhuǎn)染后,與siRNA 對照組比較,各組沙鼠肝細胞Pnpla3 蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05 或P<0.01),siRNA2 組和siRNA3 組mRNA 表達水平顯著降低(P<0.05 或P<0.01),其中siRNA2 組敲減效果最好,干擾效率高于70%,因此選取siRNA2 組進行實驗。

注:造模后肝實質(zhì)細胞的生長形態(tài)列于 A～E。A:對照組;B～E:加入 100 μmol/L,200 μmol/L,400 μmol/L 和 800 μmol/L PA 后的細胞形態(tài)。圖1 PA 造模濃度的篩選Note.Growth status of hepatocyte after modeling are listed in A～E.A, Control group.B～E,100 μmol/L,200 μmol/L,400 μmol/L and 800 μmol/L PA, respectively.Figure 1 Screening of PA model concentration

2.2 靈芝三萜酸降脂效果

加入藥后,細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h,檢測TG 含量,根據(jù)圖5 可知,與空白對照組相比,肝細胞+PA 組與肝細胞+PA+siRNA 組肝細胞TG 含量極顯著升高(P<0.01);與肝細胞+PA 組相比,肝細胞+PA+藥物低劑量組+siRNA 組、肝細胞+PA+藥物中劑量組、肝細胞+PA+藥物中劑量組+siRNA 組、肝細胞+PA+藥物高劑量組、肝細胞+PA+藥物高劑量組+siRNA 組與肝細胞+PA+陽性藥物蛋氨酸組肝細胞TG 含量顯著降低(P<0.05 或P<0.01);與肝細胞+PA+siRNA 組相比,肝細胞+PA+藥物中劑量組+siRNA組與肝細胞+PA+藥物高劑量組+siRNA 組肝細胞TG 含量顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。這個結(jié)果提示干擾Pnpla3 基因可以起到降低TG 含量的作用,單獨加入中、高劑量的靈芝三萜酸有明顯的降脂效果,干擾Pnpla3 基因與加入靈芝三萜酸具有累積降脂效應。

3 討論

目前用于復制肝脂變模型的細胞主要有L02、QSG-7701[10]、HepG2[11],及小鼠肝細胞 AML[12],造模單用油酸(OA,硬脂酸)、單用棕櫚酸(PA,軟脂酸)及棕櫚酸與油酸配合法(1 ∶2)來誘導,所造成肝細胞損傷與NAFLD 的病變相似[13-14]。本研究獲得了長爪沙鼠原代肝細胞最佳成模型時間和棕櫚酸的劑量,明確了最佳干擾(敲低)Pnpla3 的時間和載體(外顯子序列),發(fā)現(xiàn)敲低Pnpla3 可減輕脂滴形成,提示我們Pnpla3 基因與 TG 的合成與積累有關[15],而敲除野生型Pnpla3 基因的小鼠模型沒有相關表型或許與小鼠特殊的脂清除機制有關[16]。因此,僅采用PA 誘導就達到了相同的效果,所需要的條件與人的肝細胞(L02,HepG2,有永生化特征),小鼠的肝細胞(AML,有永生化特征)相當,且使用新鮮分離的肝原代細胞,減少了由于永生化等造成基因突變的影響,最大限度地模擬了活體肝細胞的狀態(tài)。干擾Pnpla3 基因后,長爪沙鼠肝細胞表現(xiàn)出的甘油三酯含量的改變與人Pnpla3 基因效應的研究結(jié)果一致,也與沙鼠用高脂飼料造模2 周出現(xiàn)脂肪肝的結(jié)果相吻合,同時再次證實了NAFLD 沙鼠模型在細胞水平的特色。

注:A:對照siRNA;B:Pnpla3 siRNA。圖2 Pnpla3 siRNA 干擾對長爪沙鼠肝實質(zhì)細胞脂肪沉積的影響Note.A, NC siRNA.B, Pnpla3 siRNA.Figure 2 Effect of Pnpla3 siRNA interference on fat deposition in the parenchymal liver cells of Mongolian gerbils

注:A:空白組;B:siRNA 對照組;C:siRNA1;D:siRNA2;E:siRNA3。與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P <0.01。圖3 qPCR 檢測Pnpla3 siRNA 轉(zhuǎn)染后沙鼠肝實質(zhì)細胞中Pnpla3 mRNA 表達水平( x_ ±s,n=3)Note.A, control group.B, siRNA control.C, siRNA1.D, siRNA2.E, siRNA3.Compared with the control group,▲ P<0.05, ▲▲ P <0.01.Figure 3 qPCR detection of Pnpla3 mRNA expression level in parenchymal liver cells of Mongolian gerbils after Pnpla3 siRNA transfection

注:A:空白組;B:siRNA 對照組;C:siRNA1;D:siRNA2;E:siRNA3。與空白組比較,▲P<0.05,▲▲P <0.01。圖4 Western blot 檢測Pnpla3 siRNA 轉(zhuǎn)染后長爪沙鼠肝實質(zhì)細胞中Pnpla3 蛋白表達水平( x_ ±s,n=3)Note.A, control group.B, siRNA control.C, siRNA1.D,siRNA2.E, siRNA3.Compared with the control group,▲P<0.05, ▲▲ P <0.01.Figure 4 Western blot detects Pnpla3 protein expression level in gerbil liver cells after Pnpla3 siRNA transfection

注:A:空白對照組;B:肝細胞+PA 組;C:肝細胞+PA+siRNA組;D:肝細胞+PA+藥物低劑量組;E:肝細胞+PA+藥物低劑量組+siRNA 組;F:肝細胞+PA+藥物中劑量組;G:肝細胞+PA+藥物中劑量組+siRNA 組;H:肝細胞+PA+藥物高劑量組;I:肝細胞+PA+藥物高劑量組+siRNA 組;J:肝細胞+PA+陽性藥物蛋氨酸組。與空白對照組比較,▲P<0.05,▲▲P <0.01;與肝細胞+PA 組相比,★P<0.05,★★P<0.01;與肝細胞+PA+siRNA 組相比,#P<0.05,##P<0.01。圖5 沙鼠肝細胞中甘油三酯(TG)含量變化情況( ±s,n=3)Note.A, control.B, liver cell+PA group.C, liver cell+PA+siRNA group.D, liver cell+PA+ low (0.01 μmol/L) dose group.E, liver cell+PA+ low (0.01 μmol/L) dose +siRNA group.F,liver cell+PA+medium(0.1 μmol/L).G,liver cell+PA+ medium (0.1 μmol/L) dose +siRNA group.H, liver cell+PA+high (1 μmol/L) group.I,liver cell+PA+high (1 μmol/L) dose +siRNA group.J, liver cell+PA+ methionine group.Compared with the control group, ▲P<0.05,▲▲ P <0.01.Compared with the hepatocyte+PA group, ★P<0.05,★★ P<0.01.Compared with the hepatocyte+PA+siRNA group, #P<0.05,##P<0.01.Figure 5 Changes of TG content in parenchymal liver cells of Mongolian gerbils

除靈芝多糖研究較多外,靈芝三萜類物質(zhì)明確降脂機理的研究較少。本實驗中通過設置靈芝三萜酸(GLTA)的高中低三個劑量梯度、干擾(敲低)Pnpla3 及陽性藥物蛋氨酸對TG 含量的觀察,結(jié)果表明低劑量GLTA 并對TG 含量沒有影響,但當干擾Pnpla3 表達之后卻能夠降低TG 含量,提示單獨使用小劑量GLTA 對TG 含量影響較小,經(jīng)Pnpla3敲低后才能明顯發(fā)揮影響TG 的作用。這一點我們從單獨使用的陽性藥蛋氨酸的降脂效果可以對比確認。而提高GLTA 濃度后表明中高劑量GLTA 及干擾Pnpla3 均能夠顯著影響減少TG 含量,且存在明顯的量效關系,即GLTA 對干擾Pnpla3 基因后的長爪沙鼠肝細胞中TG 的含量有明顯的抑制或減輕作用,這提示GLTA 降脂效應與Pnpla3 相關。我們之前的結(jié)果顯示長爪沙鼠NFALD 模型Pnpla3 與磷脂代謝相關2 個通路(ko00561,ko00564)中Pnpla3上調(diào)10 倍以上[17],而GLTA 可能通過Pnpla3 表達發(fā)揮影響脂肪合成及代謝的作用。另外,本研究結(jié)果也提示了GLTA 類似的化合物治療NAFLD 的潛在機制。

綜上所述,建立長爪沙鼠原代肝實質(zhì)脂變細胞模型,并初步驗證了干擾Pnpla3 的降脂效應,在一定程度上說明了GLTA 的一種降脂原因,但如想說明GLTA 是通低調(diào)節(jié)Pnpla3 的表達量而起作用還需要嚴謹?shù)仳炞C,因此本課題組準備在后期的研究中增加Pnpla3 基因高表達組并且通過檢測GLTA加入后對Pnpla3 基因的表達是否有直接影響來證明。