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(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;河北省器官纖維化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;河北省慢性病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北唐山 063210)

塵(矽)肺病目前已經(jīng)成為世界重大職業(yè)衛(wèi)生安全問題,其病因明確,可控可防,但缺乏有效治療手段。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)在實(shí)驗(yàn)性矽肺大鼠模型中激活,并介導(dǎo)肺泡II 型上皮細(xì)胞的凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程;而N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetylseryl-aspartyl-lysyl-proline, Ac-SDKP)治療能通過保護(hù)肺泡II 型上皮細(xì)胞,拮抗上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程,進(jìn)而抑制膠原沉積,延緩實(shí)驗(yàn)矽肺大鼠模型的肺纖維化病程進(jìn)展[1-2]。最近研究認(rèn)為,細(xì)胞衰老與慢性肺疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密,其代表性信號(hào)因子,如毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變激酶(ataxia telangiectasia-mutated gene, ATM)、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào) Rad3 相關(guān)激酶(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase, ATR 和 p53 蛋白的依次激活,引起 p16INK4a 信號(hào)、p21CIP1 信號(hào)活化,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[3-5]。然而,衰老相關(guān)信號(hào)在矽肺纖維化過程中是否激活,且Ac-SDKP 對(duì)衰老相關(guān)信號(hào)的作用仍未所知。因此本研究擬觀察Ac-SDKP 能否通過對(duì)肺泡II 型上皮細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)的調(diào)節(jié)從而發(fā)揮拮抗矽肺纖維化的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí),3 周齡 Wister 雄性大鼠(80±10)g30 只購于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0008],置于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(冀)2020-0007]飼養(yǎng),溫度為 20 ℃ ～26℃,相對(duì)濕度為40% ～70%,12 h 進(jìn)行一次晝夜交替,動(dòng)物自由取食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LX2019035)。并且在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照3R 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

SiO2粉塵購于美國Sigma 公司;Ac-SDKP 購于瑞士Bachem AG 公司;細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、培養(yǎng)基等購自以色列BI 公司;天狼星紅染色試劑盒購于中國貝索公司;熒光二抗購于美國Novex 公司;含DAPI 封片劑購于美國abcam 公司;免疫印跡總蛋白提取試劑盒由中國英文特生物提供;p21 購于BD Pharmingen 公 司; 表 面 活 性 蛋 白 C 前 體(prosurfactant Protein C, proSP-C) 購于美國millipore 公司;Col I、ATM、ATR 由中國武漢博士德公司提供;p-ATM、p-ATR 由美國 Affinit 公司提供;p-p53-s15、p16 購于中國 ABclonal 公司;p53 購于中國 arigo 公司;二抗購買于美國KPL 公司;ECL 發(fā)光試劑由中國莊盟國際公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)性矽肺模型的建立

大鼠實(shí)驗(yàn)分組(每組10 只)為:(1)對(duì)照組:置于染塵柜,吸入純凈氣3 h/d,每周5 天,16 周后腹腔內(nèi)埋入含0.9%生理氯化鈉溶液200 μL 微量緩釋膠囊至24 周結(jié)束;(2)矽肺模型組:置于染塵柜,吸入50 μg/m3SiO2,每周5 天,16 周后腹腔內(nèi)埋入含0.9%生理氯化鈉溶液200 μL 微量緩釋膠囊至24 w結(jié)束;(3)Ac-SDKP 治療組:造模條件同矽肺模型組,腹腔內(nèi)埋入含800 μg/kg·d Ac-SDKP 的0.9%生理氯化鈉溶液200 μL 微量緩釋膠囊至24 周結(jié)束[1-2,6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,4%多聚甲醛固定右下肺,將其余肺組織-80℃保存?zhèn)溆糜糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株 MLE-12 細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中,用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng),采用第3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),同步化24 h 后分為4 組:(1)對(duì)照組;(2)SiO2誘導(dǎo)組:0.05 g/L SiO2;(3)Ac-SDKP 組:10-8mol/L Ac-SDKP;(4)SiO2+Ac-SDKP組:先給予 Ac-SDKP 處理 30 min,再給予 SiO2誘導(dǎo)[7]。

1.3.3 天狼星紅染色

石蠟切片脫蠟至水,鐵蘇木素染核1 ～2 min,滴加天狼星紅染液室溫染色1 h,棄去染色液,95%乙醇脫色,無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。計(jì)數(shù)膠原面積分布百分比。

1.3.4 免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟至水,H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,高壓修復(fù),一抗 p21(1 ∶200)、proSP-C(1 ∶200)4℃過夜;二抗37℃ 孵育30 min,用含DAPI 封片劑封片,鏡下觀察。

1.3.5 免疫印跡

提取組織/細(xì)胞總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度,以每個(gè)泳道15 μg 上樣,常規(guī)進(jìn)行電泳及電轉(zhuǎn)。一抗 Col I、p-ATM、ATM、p-ATR、ATR、p-p53-s15、p53、p21、p16,1 ∶1000 稀釋 4℃過夜;二抗 1 ∶5000 稀釋 37℃孵育40 min,ECL 發(fā)光試劑顯色。采用 Image-Pro-plus 6.0 圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析,計(jì)算經(jīng)內(nèi)參蛋白及對(duì)照組均衡后作目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ac-SDKP 抑制矽肺大鼠膠原沉積

各組動(dòng)物無死亡,其中對(duì)照組大鼠飲食、飲水及活動(dòng)情況正常,矽肺模型組以及Ac-SDKP 治療組大鼠飲食、飲水情況尚可,但活動(dòng)量明顯減少。如圖1 所示,經(jīng)動(dòng)式染塵24 周的矽肺模型組大鼠肺內(nèi)可見多個(gè)矽結(jié)節(jié)且伴有膠原沉積,而Ac-SDKP 治療組矽結(jié)節(jié)數(shù)量和矽結(jié)節(jié)面積均較矽肺模型組減少(表1)。

免疫印跡如圖2 所示,和對(duì)照組相比,矽肺模型組大鼠COL I 蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而與矽肺模型大鼠相比,Ac-SDKP 治療組COL I 蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(表2)。以上結(jié)果經(jīng)方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Ac-SDKP 對(duì)矽肺大鼠模型膠原沉積的調(diào)節(jié)作用(天狼星紅染色)Figure 1 Effect of Ac-SDKP on collagen deposition in rats exposed to silica (Sirius red staining)

2.2 Ac-SDKP 抑制細(xì)胞衰老

免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果如圖3 所示,采用proSP-C 標(biāo)記肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,可見在對(duì)照組中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞多位于肺泡連接處,在矽肺模型組及Ac-SDKP 治療組中可見肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分布于矽結(jié)節(jié)周圍,并均可見proSP-C 和p21 陽性共表達(dá)細(xì)胞。

表1 Ac-SDKP 抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠膠原沉積(%, n=10)Table 1 Ac-SDKP inhibits collage deposition in rats exposed to silica

表2 Ac-SDKP 對(duì)矽肺大鼠模型膠原沉積的調(diào)節(jié)作用( ±s)Table 2 Regulation of Ac-SDKP on collagen deposition in silicosis rat model

表2 Ac-SDKP 對(duì)矽肺大鼠模型膠原沉積的調(diào)節(jié)作用( ±s)Table 2 Regulation of Ac-SDKP on collagen deposition in silicosis rat model

注:與對(duì)照組比較,?P<0.05;與矽肺模型組比較,#P<0.05。Note.Compared with the control group, ?P<0.05.Compared with the silicosis group, #P<0.05.

組別Groups Col I對(duì)照組 Control group 1.86±0.55矽肺模型組 Dust group 6.68±1.26?Ac-SDKP 治療組 Post-Ac-SDKP group 3.85±0.63#F 26.00 P<0.001

免疫印跡結(jié)果如圖4 所示,和對(duì)照組相比,矽肺大鼠模型組中的 Col I、p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及p16 蛋白表達(dá)顯著增加,和矽肺大鼠模型組相比,Ac-SDKP 后處理組大鼠各蛋白水平明顯下調(diào)(表3)。以上結(jié)果經(jīng)方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Ac-SDKP 抑制 SiO2 介導(dǎo)的 MLE-12 細(xì)胞細(xì)胞衰老

取3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞密度為80%時(shí)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行誘導(dǎo)。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果如圖5 所示,p21 在SiO2誘導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞中高表達(dá),而Ac-SDKP 處理組中 p21的表達(dá)減弱。

細(xì)胞免疫印跡結(jié)果如圖6、表4 顯示,與對(duì)照組相比,SiO2誘導(dǎo)的 MLE-12 細(xì)胞中 Col I、p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。與SiO2誘導(dǎo)組相比,Ac-SDKP 治療組各蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),以上結(jié)果經(jīng)方差分析,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Ac-SDKP 對(duì)矽肺大鼠模型膠原沉積的調(diào)節(jié)作用Figure 2 Regulation of Ac-SDKP on collagen deposition in silicosis rat model

表3 Ac-SDKP 對(duì)染塵的矽肺大鼠 p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平的影響Table 3 Effects of Ac-SDKP on the protein levels of p-ATR, p-ATM, p-p53, p21 and p16 in SiO2-induced silicosis rats

圖3 p21 與pro-SP-C 在大鼠肺組織中的共表達(dá)(免疫熒光化學(xué)染色)Figure 3 The co-expression of p21 and pro-SPC in rats (Immunofluorescence staining)

表4 Ac-SDKP 對(duì) SiO2 誘導(dǎo)的 MLE-12 細(xì)胞 Col I、p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平的影響( ±s)Table 4 Effects of Ac-SDKP on the protein levels of Col I, p-ATR, p-ATM, p-p53,p21 and p16 in SiO2-induced MLE-12

表4 Ac-SDKP 對(duì) SiO2 誘導(dǎo)的 MLE-12 細(xì)胞 Col I、p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平的影響( ±s)Table 4 Effects of Ac-SDKP on the protein levels of Col I, p-ATR, p-ATM, p-p53,p21 and p16 in SiO2-induced MLE-12

注:與對(duì)照組比較,?P<0.05;與SiO2 誘導(dǎo)組比較,#P<0.05。Note.Compared with the control group, ?P<0.05.Compared with the SiO2 induced group, #P<0.05.

組別Groups Col I p-ATR p-ATM p-p53 P21 P16對(duì)照組 Control group 0.98±0.15 0.31±0.13 0.98±0.49 0.89±0.22 0.34±0.05 1.37±0.02 Ac-SDKP 組 Ac-SDKP group 0.94±0.03 0±0 0.67±0.13 0.62±0.08 0.17±0.01 1.12±0.06 SiO2 誘導(dǎo)組 SiO2induction group 1.54±0.15? 1.00±0.17? 1.05±0.14? 1.45±0.10? 1.09±0.14? 1.87±0.16?SiO2+ Ac-SDKP 組 SiO2+Ac-SDKP group 1.28±0.09# 0.11±0.13# 0.59±0.13# 0.89±0.18# 0.85±0.06# 1.13±0.26#F 16.71 38.57 9.91 14.86 84.44 15.21 P 0.242 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

圖4 Ac-SDKP 對(duì)染塵的矽肺大鼠p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平的影響Figure 4 Effects of Ac-SDKP on the protein levels of p-ATR,p-ATM, p-p53, p21 and p16 in SiO2-induced silicosis rats

研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能失調(diào)和端?？s短是細(xì)胞衰老的重要分子生物學(xué)基礎(chǔ),在多種慢性肺部疾患中起到了重要調(diào)控作用,促進(jìn)了特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)、慢性阻塞性肺疾病等疾病的進(jìn)展[3-5]。在塵(矽)肺纖維化研究領(lǐng)域,塵肺病患者發(fā)病工齡與接塵年齡呈反比,及接塵年齡越高,其罹患?jí)m肺的周期越短,提示塵(矽)肺的發(fā)生與老齡因素有關(guān)8]。在實(shí)驗(yàn)性矽肺大鼠模型的研究中也發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX,γH2AX)和衰老標(biāo)記物p21 在大鼠肺組織中,隨著染塵月數(shù)的增加而增加[1];在實(shí)驗(yàn)性矽肺小鼠模型中,也具有類似的表現(xiàn)[9]。而炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬,能夠驅(qū)動(dòng)p53 及其下游靶蛋白的活化,或介導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化,或促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,參與對(duì)了肺纖維化形成的調(diào)控[10-11]。提示實(shí)驗(yàn)性矽肺模型中可能伴隨著衰老信號(hào)的活化。為了證實(shí)衰老信號(hào)在矽肺纖維化進(jìn)展中是否激活,在本研究中首先檢測了應(yīng)激性衰老的相關(guān)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平在矽肺模型組中顯著上調(diào),提示在實(shí)驗(yàn)性染塵模型中存在著衰老相關(guān)信號(hào)的活化。進(jìn)一步采用肺泡II 型上皮細(xì)胞標(biāo)記物proSP-C 與衰老標(biāo)記物 p21 免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在矽肺大鼠模型肺組織中,細(xì)胞衰老主要存在于肺泡II 型上皮細(xì)胞中。

肺泡II 型上皮細(xì)胞作為肺內(nèi)干細(xì)胞,能夠向肺泡I 型上皮細(xì)胞分化,并具有重要的肺水轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫功能,因此肺泡II 型上皮細(xì)胞發(fā)生衰老,是肺纖維化重要的驅(qū)動(dòng)因素[12]。體外予以博來霉素誘導(dǎo),能夠促進(jìn)肺泡II 型上皮細(xì)胞衰老,伴隨著p21、p16蛋白表達(dá)水平的上調(diào)[13]。而SiO2能夠在體外誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生DNA 雙鏈斷裂,進(jìn)而激活A(yù)TM,從而引起了炎癥反應(yīng)和DNA 損傷的積聚[14]。因此在本研究中,采用較低劑量的SiO2誘導(dǎo),細(xì)胞活力未見明顯改變,但 p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平顯著上調(diào),提示 50 μg/mL 劑量的SiO2能夠誘導(dǎo)MLE-12 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老,伴隨著I 型膠原蛋白水平的上調(diào)。上述結(jié)果提示,肺泡II 型上皮細(xì)胞的衰老可能與矽肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

注:A:DAPI;B:p21;C:merged。圖5 p21 在MLE-12 細(xì)胞中的表達(dá)(免疫熒光化學(xué)染色)Note.A, DAPI.B, p21.C, merged.Figure 5 Expression of p21 in MLE-12 cells (Immunofluorescence staining)

圖6 Ac-SDKP 對(duì) SiO2 誘導(dǎo) MLE-12 細(xì)胞 Col I、p-ATR、p-ATM、p-p53、p21 及 p16 蛋白水平的影響Figure 6 Effects of Ac-SDKP on the protein levels of Col I,p-ATR, p-ATM, p-p53, p21 and p16 in SiO2-induced MLE-12

Ac-SDKP 是一類具有抗炎和抗矽肺纖維化作用的短肽,在多種纖維化模型中均發(fā)現(xiàn)其能夠拮抗器官纖維化進(jìn)展,具有很好的臨床轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)[12,15]。最近課題組研究結(jié)果也顯示,Ac-SDKP 可通過調(diào)節(jié)腎素血管緊張素系統(tǒng),從而參與對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺纖維化的阻抑效應(yīng)[7,16-17]。在本研究中,進(jìn)一步完善和補(bǔ)充了Ac-SDKP 的抗器官纖維化作用機(jī)制,即Ac-SDKP 能夠顯著抑制SiO2介導(dǎo)的肺泡II 型上皮細(xì)胞的衰老,從而拮抗了矽肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。