張微，關(guān)永霞，韓振明，馮倩，馬健，杜昊忱*，張貴民

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沂 276006

柴銀制劑是治療風(fēng)熱感冒的三類中成藥，具有清熱解表、宣肺泄熱、化痰利咽止咳的功效，用于治療風(fēng)熱之邪侵襲而致邪襲肺衛(wèi)之發(fā)熱惡寒、頭痛咳嗽、咽紅腫痛、舌邊尖紅、脈浮數(shù)之風(fēng)熱表實(shí)證[1]。柴銀制劑具有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)、解痙及清除氧自由基作用，其中有顯著的生物活性的黃芩苷為柴銀制劑的主要指標(biāo)成分?，F(xiàn)階段，單獨(dú)提取黃芩藥材中的黃芩苷時(shí)，主要采用水提酸沉法[2]、堿提酸沉法或乙醇直接提取法[3-4]。通過(guò)檢索，黃芩苷提取是國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥保健領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但關(guān)于黃芩制劑合并提取、醇沉工藝的研究相對(duì)較少，主要原因?yàn)辄S芩苷在冷水和醇中的溶解度低，導(dǎo)致黃芩相關(guān)制劑的醇沉過(guò)程會(huì)損失較大比例的黃芩苷，柴銀制劑的醇沉過(guò)程亦存在同樣問(wèn)題。黃芩苷轉(zhuǎn)移率低是柴銀制劑質(zhì)量提升的限制因素，柴銀制劑水提液含有糊化淀粉、脂溶性色素、油脂等，為保證中成藥的安全性、穩(wěn)定性和有效性，需要對(duì)提取液精制純化。

現(xiàn)代中藥生產(chǎn)常用的精制方法是醇沉除雜[5]，有關(guān)醇沉工藝及醇沉機(jī)制的報(bào)道較少[6]。醇沉工藝是一個(gè)除雜取精的過(guò)程，考慮所選溶劑含醇量、加醇方式、醇沉溫度、終點(diǎn)乙醇含量等多方面因素，目的是降低雜質(zhì)在醇溶液中溶解度的同時(shí)有效成分溶解度可控而進(jìn)行除雜取精。研究初期可以選用單因素試驗(yàn)考察[7]，但無(wú)法綜合反映各因素之間的交互作用，而正交試驗(yàn)是評(píng)價(jià)多因素共同作用的一個(gè)常規(guī)評(píng)價(jià)方法[8-10]，但正交試驗(yàn)只反映醇沉工藝中“取精”的一面，無(wú)法反映 “除雜”在醇沉工藝的結(jié)果。

本研究將“取精”與“除雜”兩方面相結(jié)合。因中藥成分復(fù)雜、治療機(jī)制復(fù)雜，不可一味追求除雜，降低干物質(zhì)量，要在兩者中找到一個(gè)平衡點(diǎn)來(lái)使其對(duì)立統(tǒng)一。本研究以黃芩苷的含量和醇沉上清液干物質(zhì)量作為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，確定柴銀口服液最佳醇沉工藝。通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，醇沉一段時(shí)間內(nèi)，黃芩苷保留率逐漸升高，達(dá)到最佳時(shí)間后黃芩苷的保留率反而下降，且醇沉?xí)r間對(duì)上清液所含干物質(zhì)量影響不大。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿化乙醇2步醇沉后得到的黃芩苷含量高于簡(jiǎn)單1步醇沉，因此，本研究將2步醇沉作為突破點(diǎn)，對(duì)其工藝條件進(jìn)行探討。從大生產(chǎn)的安全性和實(shí)用性考慮，2步醇沉中預(yù)醇沉所用低濃度的堿化乙醇體積為清膏體積的2倍，醇沉?xí)r間選用最佳黃芩苷保留時(shí)間，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用。因此，本研究采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)柴銀口服液提取的清膏進(jìn)行醇沉工藝條件的優(yōu)化，并結(jié)合醇沉上清液的干物質(zhì)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定黃芩苷含量，篩選最優(yōu)醇沉工藝。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；R2002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；XS204型電子分析天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥

柴銀口服液提取清膏(魯南厚普實(shí)驗(yàn)室制備，密度為1.12)；高效液相用試劑均為色譜純；分析用試劑均為分析純；黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201821,CAS：21967-41-9，純度≥98%)。

2 方法

2.1 黃芩苷含量測(cè)定

黃芩苷含量測(cè)定方法參考《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015年版一部柴銀口服液項(xiàng)下HPLC測(cè)定黃芩苷含量的方法，柴銀口服液提取清膏液相色譜圖及黃芩苷對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖1，計(jì)算醇沉上清液黃芩苷含量，并按公式(1)計(jì)算黃芩苷轉(zhuǎn)移率(α)。

α=(醇沉上清液黃芩苷含量/柴銀口服液提取清膏黃芩苷含量)×100%

(1)

注：A.供試品溶液；B.對(duì)照品溶液。

2.2 干物質(zhì)得率測(cè)定方法

干物質(zhì)得率測(cè)定方法參考《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0831“干燥失重測(cè)定法”，精密量取醇沉上清液10 mL，稱量，記錄上清液質(zhì)量，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱，干燥至恒重，干燥器中冷卻至室溫，稱質(zhì)量，按公式(2)計(jì)算干物質(zhì)得率(δ)。

δ=(干物質(zhì)質(zhì)量/上清液質(zhì)量)×100%

(2)

2.3 醇沉?xí)r間考察

稱取5份柴銀口服液提取清膏，每份35 g，分別以10 mL·min-1勻速加入pH=7、60%乙醇62.5 mL，再以10 mL·min-1勻速加入95%乙醇，使藥液終點(diǎn)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，于2～4 ℃溫度下靜置，分別于12、16、20、24、30、36 h取樣，并量取上清液體積，測(cè)定黃芩苷含量并計(jì)算黃芩苷轉(zhuǎn)移率，計(jì)算干物質(zhì)得率。

2.4 醇沉工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取柴銀口服液提取清膏，根據(jù)醇沉的影響因素及有效成分的性質(zhì)，對(duì)預(yù)醇沉所用堿化乙醇的pH(A)、堿化乙醇含醇量(B)及二次醇沉所用高濃度乙醇的含醇量(C)進(jìn)行考察。為使醇沉工藝更趨合理，本研究采用了L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，開(kāi)展醇沉工藝優(yōu)化。根據(jù)表1，取柴銀口服液提取清膏，每份含有黃芩苷5 g，共計(jì)9份，按設(shè)計(jì)方案進(jìn)行醇沉。醇沉后攪勻，冷藏24 h，濾過(guò)，得醇沉上清液。以黃芩苷為考察指標(biāo)，測(cè)定醇沉上清液中黃芩苷的含量。

表1 柴銀口服液提取清膏醇沉試驗(yàn)正交因素水平

2.5 最佳醇沉工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按批次量擴(kuò)大20倍稱取柴銀口服液提取清膏，共計(jì)3份，加入清膏體積2倍量的pH為8、含醇量為60%的堿化乙醇進(jìn)行預(yù)醇沉，攪拌均勻后，再加入含醇量為85%的乙醇進(jìn)行二次醇沉至醇沉液含醇量達(dá)60%，醇沉后攪勻，冷藏24 h，濾過(guò)，得醇沉上清液。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同醇沉?xí)r間考察結(jié)果

不同醇沉?xí)r間對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率、干物質(zhì)得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：A.黃芩苷轉(zhuǎn)移率；B.干物質(zhì)得率。

由圖2A可知，在一定范圍內(nèi)，隨著醇沉?xí)r間的延長(zhǎng)，黃芩苷保留率逐漸升高。當(dāng)時(shí)間超過(guò)24 h時(shí)，黃芩苷保留率反而開(kāi)始下降，這是由于隨時(shí)間延長(zhǎng)沉淀越來(lái)越板結(jié)，容易把黃芩苷包裹夾帶其中不容易釋放出來(lái)，再者隨時(shí)間延長(zhǎng)，分子之間的范德華力也會(huì)使一部分黃芩苷沉降下來(lái)而造成的損失。圖2B則表明，醇沉?xí)r間對(duì)干物質(zhì)得率影響不大，雜質(zhì)在乙醇溶液中的析出在12 h內(nèi)已達(dá)到平衡，再延長(zhǎng)醇沉?xí)r間對(duì)雜質(zhì)去除變化不大。綜上，確定最佳醇沉?xí)r間為24 h。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1正交試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 9組正交試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果中的黃芩苷含量、干物質(zhì)得率與黃芩苷轉(zhuǎn)移率見(jiàn)圖3。

注：A.黃芩苷含量；B.干物質(zhì)得率；C.黃芩苷轉(zhuǎn)移率。

3.2.2正交試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果方差分析、主效應(yīng)分析與直觀分析 對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)方差分析可以看出，各正交試驗(yàn)組之間黃岑苷保留率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

將黃芩苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行主效應(yīng)分析，見(jiàn)圖4。

表2 正交試驗(yàn)醇沉上清液黃芩苷含量方差分析

圖4 9組正交試驗(yàn)黃芩苷轉(zhuǎn)移率主效應(yīng)圖

正交試驗(yàn)醇沉上清液黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果直觀分析見(jiàn)表3。由表3可知，堿化乙醇pH為8的高于pH為7和9的對(duì)醇沉黃芩苷損失影響；預(yù)醇沉堿化乙醇50%含醇量與60%含醇量比較，醇沉黃芩苷損失相差不大，預(yù)醇沉堿化乙醇含醇量60%略高于堿化乙醇含醇量50%和70%，二次醇沉含醇量85%略高于二次醇沉含醇量70%，且高于二次醇沉含醇量95%，堿化乙醇pH和堿化乙醇含醇量對(duì)黃芩苷影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但二次醇沉含醇量對(duì)降低醇沉工藝黃芩苷的損失差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但A2B2C2均略高于預(yù)醇沉堿化乙醇含醇量50%和二次醇沉含醇量為70%的乙醇。因此，從實(shí)際生產(chǎn)考慮，醇沉工藝及之后乙醇回收過(guò)程中的時(shí)間、能耗成本和資源節(jié)約、操作方便性的角度考慮，及由正交試驗(yàn)直觀分析和方差分析結(jié)果可以確定最佳醇沉工藝為A2B2C2，即預(yù)醇沉堿化乙醇pH為8，堿化乙醇含醇量為60%，二次醇沉乙醇含醇量85%。

表3 正交試驗(yàn)醇沉上清液黃芩苷含量直觀分析

3.3 最佳醇沉工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)上述優(yōu)化后的醇沉工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次醇沉上清液平均體積為77.05 L，平均黃芩苷轉(zhuǎn)移率為90.08%，結(jié)果與小試工藝優(yōu)選結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，醇沉上清液體積和總黃芩苷含量的結(jié)果，其RSD均小于3%，表明工藝穩(wěn)定、合理。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)以柴銀口服液提取清膏為原料，研究了柴銀口服液醇沉工藝對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率的影響；在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中，醇沉工藝采用加入浸膏體積2倍量的預(yù)醇沉堿化乙醇pH為8、堿化乙醇含醇量為60%、二次醇沉乙醇含醇量85%，醇沉后上清液中黃芩苷轉(zhuǎn)移率最高為90.08%。該方法增加黃芩苷在醇溶液中溶解度，減少由于夾帶沉淀造成損失，依據(jù)相關(guān)物質(zhì)的得失均衡，醇沉上清液中黃芩苷的含量體現(xiàn)有效成分的保留，醇沉上清液的干物質(zhì)質(zhì)量反映雜質(zhì)的去除，從而達(dá)到醇沉工藝去除雜質(zhì)而提高藥品療效的目的，因此，小試的最佳醇沉工藝可為中試和大生產(chǎn)工藝提供有利的數(shù)據(jù)支持。

該研究為柴銀制劑工業(yè)醇沉工藝提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于其他含有黃芩苷中成藥的醇沉工藝優(yōu)化也有借鑒作用。該醇沉工藝試驗(yàn)結(jié)果表明，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，可降低醇沉工藝對(duì)黃芩苷的損失，保證柴銀制劑大生產(chǎn)的產(chǎn)品中黃芩苷含量及臨床療效，為含有黃芩苷且有醇沉工藝的中成藥品種生產(chǎn)提供參考。