張憲寶，王耘

北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

澤漆為大戟科植物澤漆EuphorbiahelioscopiaLinn.的干燥全草，廣布于全國[1]。澤漆味苦，性微寒，有毒，歸肺、小腸、大腸經，具有很好的利水消腫、消痰退熱、散結殺蟲等功效[2]。雖然有毒，但其毒性較小[3]。在古今臨床應用中，澤漆具有確切的治療肺癌的功效。《金匱要略》中記載：“咳而脈沉者，澤漆湯主之”，因該論述太過簡略，導致澤漆沒有得到應有的重視[4]。隨著現代中藥在腫瘤治療方面的應用效果良好，澤漆也被證實有良好的抗腫瘤活性，澤漆湯[5]、澤漆湯加減[6]、葶藶澤漆湯[7]等方劑在臨床肺癌治療中都發(fā)揮了確切的治療作用。然而目前對澤漆的研究多為成分鑒定、分析及體內、體外活性的初步研究[8]，其治療肺癌的分子機制和途徑尚不完全明確，有待深入解析。

本研究結合中藥學和生物學領域多種數據庫(中藥成分、靶點、蛋白相互作用及疾病相關靶點等)，以實體語法系統(tǒng)(entity grammar system，EGS)為框架，利用定性推理技術系統(tǒng)地推導澤漆成分的作用靶點與肺癌相關靶點的相互作用關系，解析澤漆治療肺癌的分子機制和途徑，為澤漆的進一步研究提供參考。

1 數據來源與方法

1.1 數據來源

澤漆中含有的化學成分來源于中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺[9](traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)。澤漆化學成分的靶點信息以及化學成分對靶點的作用信息(促進或抑制)來源于DrugBank[10]、STITCH[11](search tool for interacting chemicals)、BindingDB[12](bingding database)和TTD[13](therapeutic target database)數據庫。蛋白質相互作用背景網絡來源于String[14]數據庫。為了保證應用EGS進行定性推理的準確性，本研究只采用了具有明確抑制作用或者促進作用的蛋白-蛋白相互作用(PPI)關系。肺癌相關靶點數據來源于OMIM[15](online mendelian inheritance in man)、GENE[16]、KEGG[17](Kyoto Encyclopedia of genes and genomes)和DrugBank數據庫。

1.2 EGS定性推理系統(tǒng)的數學原理

EGS是一種形式化的語法系統(tǒng)，朝向復雜生物系統(tǒng)建模[18]。一般情況下，EGS用五元組G=(VN，VT，F，P，S)表示，其中VT(末端字符)和VN(非末端字符)指系統(tǒng)中的基本元素，F表示基本元素之間的結構關系，P代表由已知實體產生新實體的推理規(guī)則，S表示系統(tǒng)初始狀態(tài)。當無需考慮或者區(qū)分末端字符和非末端字符時，實體語法系統(tǒng)可以用四元組G=(V，F，P，S)表示，其中V=VN∪VT。由于EGS具有可擴展性，已經被用于建立化學過程的調控工程圖模型[19]并用于闡明中藥的分子機制[20]。

中藥具有多成分、多靶點的性質，在作用機制解析時本研究采取了如下考慮。對應給定的疾病D，中藥的化學成分可以分為3個部分，第一部分為直接作用于疾病D靶點的成分，第二部分為可通過蛋白相互作用等生物作用間接作用于疾病D靶點的成分，第三部分為和疾病D靶點無關的成分。EGS利用有向網絡進行推理的優(yōu)點為不僅可以獲得中藥中直接作用于疾病的成分和靶點，也可以獲得通過間接方式作用于疾病的成分和靶點。

本研究基于EGS構建澤漆治療肺癌的作用機制解析系統(tǒng)：V包含各種不同的節(jié)點，中藥(澤漆)、化學成分、蛋白質和疾病(肺癌)；F包含包括各種節(jié)點間的關系以及相互作用；P則定義了節(jié)點之間的推理規(guī)則；S為系統(tǒng)的初始狀態(tài)。其具體的數學原理如下。

V=V1∪V2∪V3∪V4∪V5

V1是中藥的集合，此處V1={澤漆}，V2是中藥澤漆化學成分的集合，V3是澤漆化學成分靶標的集合，V4是人類蛋白質的集合，V5是肺癌目前已知相關蛋白的集合，其中V4?V3∪V5；

F={include(X，Y)，com2tar(X，Y，Z)，dis_tar(X)，link(X，Y，Z)，draw(X，Y，Z，M)，step(X，Y，Z，M)，minstep(X，Y，Z，M)}.

在include(X，Y)中，X=“澤漆”，Y∈V3；在com2tar(X，Y，Z)中，X∈V2，Y∈V3，Z∈{“activation”，“inhibition”}；在dis_tar(X)中，X∈V5；在link(X，Y，Z)中，X∈V4，Y∈V4，Z∈{“activation”，“inhibition”}；在draw(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V4，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，…，n}；在step(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V5，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，…，n}；在minstep(X，Y，Z，M)中，X∈V2，Y∈V5，Z∈{“activation”，“inhibition”}，M∈{1，2，3，4，…，n}。

上述F中包含的基本關系類型為初始狀態(tài)以及在系統(tǒng)推理過程中產生的全部節(jié)點關系。include(X，Y)定義中藥X含有化學成分Y，本研究中X特指澤漆；com2tar(X，Y，Z)表示了中藥成分X和作用靶標Y之間的作用關系為Z；link(X，Y，Z)定義了蛋白質X和蛋白質Y之間的作用關系為Z；draw(X，Y，Z，M)定義了中藥成分X經過M步以作用方式Z作用于蛋白質Y；step(X，Y，Z，M)表示中藥成分X經過M步以作用方式Z作用于肺癌相關蛋白Y，而minstep(X，Y，Z，M)則表示中藥成分X作用于肺癌相關蛋白Y所需的最小步數。值得注意的是，在不同的節(jié)點關系中，變量X、Y、Z、M、N等可表示不同的意義，而在相同的節(jié)點關系中盡管表示變量的字母不同，其含義相同，即字母在變量中的位置決定變量的具體含義。

P=P1∪P2∪P3∪P4∪P5∪P6∪P7，

P1={include(H，X)，com2tar(X，Y，R) ? draw(X，Y，R，1)}，

P2={draw(X，Y，“activation”，N)，

link(Y，B，“activation”)，M=N+1 ? draw(X，B，“activation”，M)}，

P3={draw(X，Y，“activation”，N)，

link(Y，B，“inhibition”)，M=N+1 ? draw(X，B，“inhibition”，M)}，

P4={draw(X，Y，“inhibition”，N)，

link(Y，B，“activation”)，M=N+1 ? draw(X，B，“inhibition”，M)}，

P5={draw(X，Y，“inhibition”，N)，

link(Y，B，“inhibition”)，M=N+1 ? draw(X，B，“activation”，M)}，

P6={draw(X，Y，Z，M)，dis_tar(D)，Y=D? step(X，D，R，M)}，

P7={#min{M：step(X，D，R，M)}=W，step(X，D，R，W) ? minstep(X，D，R，W)}.

規(guī)則P1用來推理中藥澤漆的化學成分和靶點之間的關系并作為推理的起點；規(guī)則P2～P5用來推理中藥化學成分到肺癌相關蛋白的作用關系和所有路徑的距離，在此可根據具體研究設置不同對N作限定；規(guī)則P2中X到Y的作用方式為“activation”，Y到B的作用方式為“activation”，則X到B的作用方式為“activation”，同理可了解P3～P5中包含的另外3種作用方式的推理；一個化學成分作用于某個疾病相關蛋白可能經過多條路徑。

S=S1∪S2∪S3，

S1={include(H，X)，com2tar(X，Y，R)，link(X，Y，R)}，

S2={dis_tar(X)}，

S3={draw(X，Y，R，1)}.

S1是用EGS用來研究推理的具體初始信息，包括中藥澤漆含有的化學成分、成分作用靶點及人類蛋白質相互作用信息；S2代表推導的終點，即肺癌已知相關靶點；S3代表推導的起點，用數字1標記作為推導的第一步。

1.3 分子對接

為保證EGS推理的可靠性，采用分子對接技術對利用相似性搜索獲得的成分靶點關系進行驗證。靶點蛋白晶體結構從PDB(protein data bank)數據庫中搜索下載，優(yōu)先選擇含有相應生物活性配體且分辨率高的蛋白晶體。將獲得的蛋白晶體進行刪去配體分子和水分子、補全不完整氨基酸殘基、刪除多余蛋白質構象和加氫等預處理。利用LibDock工具，conformation method 參數設置為“BEST”，docking preferences參數設置為“High Quality”，其余參數為默認，進行分子對接。記錄分子對接打分值LibDock Score，選取最優(yōu)構象分析小分子和蛋白晶體間的相互作用。

1.4 富集分析

利用富集分析進一步研究由EGS推理獲得的澤漆治療肺癌的作用靶點。DAVID[21](the database for annotation and integrated discovery)是一個生物信息數據庫，為研究人員提供了一套全面的基因功能注釋工具，以了解大量基因背后的生物學意義。本研究將澤漆的直接和間接作用靶點以“Entrez Gene ID”的形式導入DAVID數據庫，在人源(homo sapiens)范圍內，對澤漆的作用靶點進行基因本體(GO)富集分析和KEGG通路富集分析。對所得結果(P<0.05)按照命中靶點的數目進行降序排序，選取排名靠前的結果，從細胞組件、分子功能、生物過程和生物通路等多方面、多層次地解析澤漆治療肺癌的潛在作用機制。

2 結果與討論

2.1 澤漆化學成分篩選及靶點檢索

在TCMSP數據庫中獲得了澤漆的79個化學成分。使用類藥五原則和口服生物利用度(OB)值對成分進行篩選，最終得到成藥性和生物利用度較好的成分14個，相關信息見表1。本研究中采取的具體規(guī)則為相對分子質量(MW)≤ 500；脂溶性(AlgP)≤5；氫鍵供體數目(HD)≤5；氫鍵受體數目(HA)≤10；OB≥30.00%。

從TTD、DrugBank、BindingDB、PubChem等數據庫檢索了表1中14個澤漆化學成分的靶點及具體生物實驗作用信息，以便于進一步的EGS推導，其中異嗪皮啶、澤漆內酯B、澤漆內酯C、天芥菜堿性、嘌呤、4′，5-二羥基-7-甲氧基黃烷酮6個化學成分的靶點信息由結構相似性搜索得到。為保證后續(xù)用于EGS進行定性推理的可靠性和準確性，本研究僅采用具有明確的促進和抑制作用的“成分-靶點”作用關系，以保證網絡的有向性。成分酒石酸未在已有數據庫找到其確切作用的靶點信息，其余13個成分的靶點信息及作用方式見表2。

表1 澤漆化學成分詳細信息

表2 澤漆化學成分靶點及具體作用信息

2.2 肺癌靶點檢索及EGS推理背景網絡構建

采用數據庫檢索的形式，以“l(fā)ung cancer”為關鍵詞，限定物種為人源(homo sapiens)，在OMIM、GENE、DrugBank和KEGG數據庫中檢索，取4個數據庫結果的并集，獲得肺癌相關靶點445個。

選取STRING數據庫中人源(homo sapiens)PPI信息(文件名9606.protein. actions.v11.0.txt.gz)，篩選其中具有明確抑制或激活作用的PPI關系，選取打分值(score)≥0.700的有向PPI關系作為后續(xù)EGS推導的背景網絡，其中包含節(jié)點(蛋白)3560個，邊19 466條，其中激活關系16 186條，抑制關系3280條。

2.3 EGS推理結果

2.3.1澤漆化學成分分析 通過EGS的定性推理，澤漆有7個潛在化學成分直接或間接地作用于55個肺癌相關靶點,進而對肺癌起到了治療作用(圖1)。7個潛在化學成分分別是木犀草素、槲皮素、山柰酚、沒食子酸甲酯、沒食子酸、澤漆內酯B、澤漆內酯C；澤漆的55個肺癌相關靶點中有11個直接作用靶點和44個通過PPI調控到的間接靶點。木犀草素是四羥基黃酮類化合物，具有消炎、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性。研究發(fā)現木犀草素既可以抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖、侵襲和遷移能力[22]，又可以抑制小細胞肺癌H1688、H446細胞的增殖、侵襲和遷移能力[23]。槲皮素為黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，可以抑制A549細胞增殖并促進其凋亡[24]，并且可以顯著抑制A549細胞的遷移和侵襲能力[25]。山柰酚是黃酮醇類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化及組織保護等多種作用。研究表明，山柰酚可誘導肺癌H446細胞的細胞周期阻滯，上調H446細胞中的p53和Bax蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，誘導細胞凋亡[26]。沒食子酸是天然植物多酚類化合物，可以通過抑制信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)信號通路，產生對A549細胞的生長抑制及凋亡誘導作用[27]。

此外，由于初始數據中的澤漆內酯作用靶點信息來源于化學相似性搜索，故采用分子對接技術對澤漆內酯B和澤漆內酯C與其靶點三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白2(ABCG2)間的作用關系進行確認。對接采用的ABCG2蛋白晶體的PDB編號為6ETI[28]，解析度為0.31 nm，該蛋白晶體共有A～F 6條鏈，作用位點在A鏈和B鏈之間。采用LibDock工具，將蛋白晶體和配體小分子以柔性的方式進行對接，結果見表3。澤漆內酯B和澤漆內酯C具有較高的分子對接打分值(表3)，同時，分析澤漆內酯B和澤漆內酯C與ABCG2之間的相互作用也具有相似性(圖2)?？梢宰鳛锳BCG2的潛在抑制劑。值得一提的是，ABCG2參與多種腫瘤的多藥耐藥過程。有研究表明，澤漆提取物可以逆轉胃癌SGC7901/DDP細胞的多藥耐藥性，這既能佐證澤漆內酯B、澤漆內酯C和ABCG2的潛在作用關系，也表明澤漆中的成分不僅可以抗腫瘤，同時也有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用。

注：不同的圖形代表不同的實體；V形節(jié)點代表澤漆的化學成分；長方形節(jié)點代表作用靶點，深紅色為實體語法系統(tǒng)推理得到的澤漆治療肺癌的直接作用靶點，紫色為間接作用靶點；箭頭的指向代表作用的方向，紅線三角形箭頭代表正向(activation)調節(jié)作用，T形箭頭代表負向(inhibition)調節(jié)作用；實線代表直接相互作用；虛線代表間接相互作用。

表3 漆內酯B、澤漆內酯C和6ETI的分子對接結果

2.3.2澤漆潛在靶點GO富集分析 將EGS推理得到的55個潛在肺癌治療靶點進行GO富集分析(限定P<0.05)。結果表明，澤漆55個潛在肺癌治療靶點參與了28個分子功能(molecular function，MF)相關術語、15個細胞組件(cellular component，CC)相關術語以及74個生物過程(biological progress，BP)相關術語(圖3)。MF主要與蛋白質結合(protein binding)、ATP結合(ATP binding)以及蛋白激酶活性(protein kinase activity)等術語有關，尤其是蛋白質結合，有45個潛在靶點與之相關，表明這些蛋白通過選擇性的非共價作用與其他蛋白或者蛋白復合物結合而發(fā)揮作用。CC主要與胞質溶膠(cytosol)、質膜(plasma membrane)、核(nucleus)、細胞質(cytoplasm)等術語相關，提示這55個潛在靶點在細胞中較為分散，有利于對癌細胞發(fā)揮綜合的調控作用。BP主要涉及凋亡過程(apoptotic process)、細胞增殖的正調控(positive regulation of cell proliferation)、細胞表面受體信號通路(cell surface receptor signaling pathway)等術語。

值得關注的是，在治療癌癥時，會采用抑制癌細胞增殖或者促進癌細胞凋亡的手段，然而生物過程卻富集到了細胞增殖的正調控、凋亡的負調控。結合澤漆成分與靶點間的關系(圖1)可知，澤漆的相關成分主要對增殖的正調控靶點以及凋亡的負調控靶點產生抑制作用，也就是實際上產生了抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是殺傷性T細胞(CTL)殺傷機制的重要組成部分。沒食子酸和木犀草素可以直接正向激活CASP3(圖1)，起到促進凋亡的作用。由此可見，通過有向網絡圖可以有效獲取正確的生物調控信息。

2.4 通路富集分析

為了進一步確認澤漆治療肺癌的多成分、多靶點、多途徑的具體作用機制，本研究將EGS得到的55個潛在靶點進行了KEGG通路富集分析，以探究更深層次的作用機制。結果表明，澤漆55個潛在靶點中有44個被富集到了29個KEGG通路(P<0.05)中，按照命中靶點數進行降序排序，取前10個信號通路(圖4)。通路分析結果表明，澤漆潛在靶點發(fā)揮效應主要和癌癥涉及通路(pathways in cancer)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(MAPK signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、黏附連接(adherens junction)等通路有關。

注：紅色字體表示A鏈中的氨基酸殘基；黑色字體表示B鏈中的氨基酸殘基。

圖3 澤漆潛在作用靶點GO富集分析結果

圖4 澤漆潛在作用靶點KEGG通路富集分析結果

MAPK級聯(lián)是一個高度保守的模塊，參與細胞增殖、分化和遷移等多種細胞功能。哺乳動物至少表達4組明顯受調控的MAPKs，即細胞外信號調節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38蛋白α/β/γ/δ(p38α/β/γ/δ)和ERK5，分別由絲分裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)、MKK4/7、MKK3/6、MEK5特異性激活。然而，每個MAPKK可以由多于1個的MAPKKK激活，增加了MAPK信號通路的復雜性和多樣性。經過實體語法系統(tǒng)推理，澤漆成分中的木犀草素可以抑制生長因子(GF)，槲皮素和沒食子酸甲酯可以抑制生長因子受體(EGFR)酪氨酸蛋白激酶(RTK)，經過MAPK信號通路的級聯(lián)反應起到抑制細胞增殖的作用(圖5)。細胞凋亡即程序性細胞死亡。Caspase-3是細胞凋亡下游的執(zhí)行者。澤漆成分中的沒食子酸和木犀草素可直接激活Caspase-3，從而促進細胞凋亡(圖5)。

PI3K-Akt信號通路被多種細胞刺激或毒性刺激激活，具有調節(jié)細胞的轉錄、翻譯、增殖、生長和存活等基本功能。PI3K催化細胞膜產生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)。PIP3反過來作為第二信使幫助激活Akt。一旦被激活，Akt可以通過磷酸化參與細胞凋亡、蛋白質合成、新陳代謝和細胞周期的底物來控制關鍵的細胞過程。周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)調控細胞從G2期到M期，使細胞進入細胞分裂周期進行增殖。槲皮素可抑制CDK1從而抑制細胞有絲分裂，使細胞無法增殖。澤漆中的木犀草素和沒食子酸甲酯通過抑制PI3K-Akt通路上游(GF和RTK，圖5)進而間接抑制Akt的活性起到促進肺癌細胞凋亡的作用。

圖5 澤漆治療肺癌潛在作用機制

經EGS推理，澤漆可能主要通過2個方面治療肺癌：1)抑制肺癌細胞增殖。澤漆可能通過木犀草素對GF的抑制、沒食子酸甲酯和槲皮素對EGFR的抑制及槲皮素對CDK1的抑制，起到了抑制肺癌細胞增殖的作用。2)促進肺癌細胞凋亡。澤漆成分中的沒食子酸和木犀草素可直接激活Caspase-3促進肺癌細胞凋亡，也可能間接抑制Akt的活性(抑制上游GF和RTK)起到促進肺癌細胞凋亡的作用。此外，澤漆中的澤漆內酯B和澤漆內酯C具有潛在的ABCG2抑制活性，發(fā)揮逆轉肺癌腫瘤多藥耐藥的功效。

3 總結與展望

本研究綜合利用中藥成分數據、化學成分活性實驗數據及人類PPI數據，通過EGS對有向網絡進行推理，獲得了木犀草素、槲皮素、山柰酚、沒食子酸甲酯、沒食子酸、澤漆內酯B、澤漆內酯C共7個澤漆治療肺癌的潛在活性成分，并得到了11個治療肺癌的直接作用靶點和44個間接作用靶點。EGS具有強大的融合和推理能力，在中藥研究中有待發(fā)揮更大的作用。本研究利用由EGS獲得的更豐富、更全面的信息，結合成分靶點關系、GO富集分析、KEGG通路富集分析等多層次的分析手段，系統(tǒng)地解析了澤漆治療肺癌的潛在分子作用機制，為澤漆治療肺癌的應用和肺癌的治療提供了參考。澤漆在肺癌治療中能抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，同時還具有潛在的逆轉多藥耐藥的功效，有待進一步研究與應用。