余 旺， 章禮久， 路 燕， 宋莎莎

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 合肥 230601

藥物性肝損傷是嚴(yán)重且致命的藥物不良反應(yīng)，對乙酰氨基酚(APAP)引起的肝損傷占藥物性肝損傷病例總數(shù)50%以上[1-2]。APAP是一種臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，當(dāng)人體過量服用時，APAP代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺與肝細(xì)胞蛋白結(jié)合，進(jìn)而引起肝損傷[3]。APAP引起肝損傷的機(jī)制包括線粒體損傷、氧化應(yīng)激、炎癥損傷以及免疫相關(guān)機(jī)制等[4-7]。肝再生對于藥物性肝損傷后肝衰竭患者的生存至關(guān)重要[8]。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)不僅是肝損傷時介導(dǎo)炎癥的分子，同時也是肝再生過程中的關(guān)鍵信號分子。有文獻(xiàn)[9-10]報道，STAT3信號分子在小鼠部分肝切除術(shù)后肝再生中有一定的作用。Jung等[11]及Río等[12]研究表明STAT3信號分子在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型中參與肝細(xì)胞的增殖。而STAT3是否在APAP誘導(dǎo)的肝損傷后肝細(xì)胞再生中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在通過體外實驗探究STAT3在APAP致急性肝損傷后肝細(xì)胞增殖過程中的作用，為APAP所致急性肝損傷后的再生修復(fù)提供可能的治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑 小鼠正常肝細(xì)胞來源的AML12細(xì)胞系購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM-F12培養(yǎng)基、insulin-Transferrin-Selenium購自美國Gibco公司；AG490 購自中國MedChemExpress公司；APAP、DMSO購自美國Sigma公司；CCK8試劑盒購自中國Biosharp公司； GADPH、p-STAT3抗體購自美國Santa Cruz公司；STAT3、Cyclin D1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體購自美國CST公司；18S、PCNA、CyclinD1和Ki67特異性引物由上海生工生物公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 使用DMEM/F-12培養(yǎng)基將小鼠肝細(xì)胞株AML12于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，2～3 d 換液1次。取對數(shù)生長期AML12細(xì)胞，加入不同濃度APAP(1、2.5、5、10、20 mmol/L)作用12、24或48 h，等體積PBS作為對照組，采用CCK8、RT-PCR實驗檢測APAP對AML12細(xì)胞增殖的影響，篩選出最適作用時間和濃度。取對數(shù)生長期AML12細(xì)胞，AG490(10、50、100 μmol/L)作用2 h后，加入APAP繼續(xù)作用48 h，采用CCK8、Western Blot、RT-PCR法檢測AG490對AML12細(xì)胞增殖的影響。

1.2.2 CCK8實驗檢測AML12細(xì)胞的活力 AML12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，胰酶消化后用DMEM/F-12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，密度1×105/ml。采用移液器按每孔100 μl將以上細(xì)胞懸液加至96孔板中。接種24 h后細(xì)胞貼壁完全，棄去細(xì)胞上層培養(yǎng)液。實驗孔分別加入100 μl預(yù)先配制好含不同濃度APAP的細(xì)胞培養(yǎng)液，APAP的濃度梯度設(shè)置如下：1、2.5、5、10、20 mmol/L。對照孔及空白對照孔均加入等體積DMEM/F-12培養(yǎng)基。每組設(shè)置5個復(fù)孔。培養(yǎng)箱中孵育12、24、48 h后加入CCK8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后放至酶標(biāo)儀上，在450 nm波長下測定各孔吸光度(absorbance,A)值。重復(fù)3次實驗。細(xì)胞活力的計算公式：細(xì)胞活力(%) = (實驗組A450 nm - 空白對照組A450 nm) / (對照組A450 nm - 空白對照組A450 nm) ×100%。不同濃度AG490(10、50、100 μmol/L)對AML12細(xì)胞活力的影響方法同上。

1.2.3 RT-PCR法檢測增殖相關(guān)基因mRNA的水平 取對數(shù)生長期AML12細(xì)胞，胰酶消化后制備成5 ml(1×105/ml)重懸液移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。分別加入2.5 mmol/L APAP刺激AML12，于 24、48 h后收取細(xì)胞。先用PBS將瓶中細(xì)胞沖洗2遍棄去上清，再加入1.5 ml TRIzol裂解液提取細(xì)胞總RNA，隨后用羅氏法完成細(xì)胞RNA的逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，放至-80 ℃冰箱保存。擴(kuò)增用LightCycle-480 PCR儀(Roche，version 1.5.0)，按95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s三步法循環(huán)擴(kuò)增50次，循環(huán)結(jié)束后通過溶解曲線檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，以18S作為 PCR 擴(kuò)增實驗的內(nèi)對照，按2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因相對比值。RT-PCR檢測AG490對APAP損傷的AML12細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA的水平方法同上。實驗中擴(kuò)增所用引物序列具體見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 Western Blot檢測AML12細(xì)胞中STAT3及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期AML12細(xì)胞，胰酶消化后制備成10 ml(1×105/ml)重懸液移至10 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。AG490作用2 h后，加入APAP繼續(xù)作用48 h，處理結(jié)束時AML12細(xì)胞棄去培養(yǎng)液后，先用PBS沖洗細(xì)胞2次后棄去上清，再加入RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白，使用BCA試劑盒及酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白定量。灌膠，垂直電泳(濃縮膠55 v，50 min；分離膠110 v，1 h)和水平電泳(200 mA，2～3 h)后蛋白即可轉(zhuǎn)到PVDF膜上，牛奶封閉4 ℃過夜，接著用一抗室溫孵育1.5～3 h(GADPH 1∶100 000、STAT3 1∶1000、p-STAT3 1∶1000、PCNA 1∶5000、Cyclin D1 1∶1000)，結(jié)束后用TBST洗滌5次，每次7 min。用二抗[兔抗小鼠IgG(1∶40 000～1∶60 000)]在搖床上室溫孵育洗滌好的PVDF膜1 h左右。用Tanon化學(xué)發(fā)光顯影儀檢測各種蛋白表達(dá)水平，在電子成像系統(tǒng)中拍攝圖片，整理后采用IPP 軟件分析各目的蛋白條帶的光密度值，標(biāo)化后進(jìn)行定量分析。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，批號：20180080，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度APAP對AML12細(xì)胞活力的影響 APAP作用24 h及48 h后，與對照組比較，各濃度APAP組AML12細(xì)胞活力均降低(P值均<0.05)(表2)。APAP濃度為2.5 mmol/L時，細(xì)胞活力分別為0.717±0.027、0.752±0.014，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，能夠滿足后續(xù)實驗條件。

表2 CCK8檢測APAP對AML12細(xì)胞活力的影響

2.2 APAP對AML12細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA水平的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，設(shè)置對照組、APAP(2.5 mmol/L)組，分別作用24 h和48 h，采用RT-PCR法檢測肝細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA水平的變化。結(jié)果顯示，與對照組比較，24 h APAP組PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均降低(P值均<0.01)；48 h APAP組Ki67 mRNA的水平升高(P<0.01)。與24 h APAP組比較，48 h APAP組PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均升高(P值均<0.01)(表3)。因此，本研究采用APAP2.5 mmol/L、刺激時間48 h來模擬體外損傷AML12細(xì)胞后肝細(xì)胞再生的模型。

2.3 AG490對AML12細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別加入0(對照組)和10、50、100 μmol/L AG490，作用2 h后加入2.5 mmol/L APAP繼續(xù)作用48 h，采用CCK8法檢測AG490對AML12細(xì)胞及APAP損傷后的AML12細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，10、50 μmol/L AG490組細(xì)胞活力變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，余各組細(xì)胞活力均降低(P值均<0.01)；與APAP 2.5 mmol/L組比較，APAP 2.5 mmol/L+AG490 50 μmol/l組和APAP 2.5 mmol/L+AG490 100 μmol/L組細(xì)胞活力降低(P值均<0.01)(表4)。因此選擇50 μmol/L AG490作為后續(xù)實驗處理濃度。

表4 AG490對AML12細(xì)胞及APAP損傷后的AML12細(xì)胞活力的影響

2.4 Western Blot檢測AML12細(xì)胞中STAT3、p-STAT3及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步探討AG490對APAP誘導(dǎo)AML12細(xì)胞損傷后增殖降低的可能作用通路，采用Western Blot法檢測STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，APAP組p-STAT3的蛋白表達(dá)上升，AG490 組、APAP+AG490 組p-STAT3的蛋白表達(dá)下降(P值均<0.05)；與APAP組比較，APAP+AG490組p-STAT3的蛋白表達(dá)下降(P<0.01)(圖1，表5)。

Western Blot法檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與APAP組比較，APAP+AG490組中PCNA、CyclinD1蛋白表達(dá)均降低(P值均<0.05)(圖2，表5)。

圖1 Western Blot法檢測AML12細(xì)胞中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況

圖2 Western Blot法檢測AG490對APAP損傷的AML12細(xì)胞PCNA、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

表5 Western blot檢測AML12細(xì)胞中STAT3及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況的定量分析結(jié)果

2.5 RT-PCR檢測AG490對APAP損傷的AML12細(xì)胞中增殖相關(guān)基因mRNA的水平 從mRNA水平探究AG490對APAP誘導(dǎo)AML12細(xì)胞損傷后增殖降低的原因，采用RT-PCR法檢測肝細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA水平的變化。RT-PCR結(jié)果顯示，與APAP組比較，APAP+AG490組PCNA、CyclinD1及Ki67 mRNA的水平均降低(P值均<0.01)(表6)。

表6 RT-PCR法檢測AG490對APAP損傷的AML12細(xì)胞中增殖相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)水平

3 討論

STAT3是一種重要并且廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，與肝細(xì)胞損傷、炎癥及肝細(xì)胞癌的發(fā)展關(guān)系緊密[13]。STAT3激活后，通過與胞質(zhì)內(nèi)2個磷酸基團(tuán)結(jié)合后，接著進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行信號傳導(dǎo)，啟動細(xì)胞DNA復(fù)制等生理過程，從而參與細(xì)胞增殖。激活的STAT3可通過調(diào)節(jié) cyclin D1 蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，使肝細(xì)胞對生長因子產(chǎn)生足夠的反應(yīng)[14]。APAP肝毒性誘導(dǎo)的肝再生涉及多種信號傳導(dǎo)介質(zhì)(包括細(xì)胞因子、生長因子、血管生成因子及其他促有絲分裂途徑)，而不同介質(zhì)之間在不同時期具有復(fù)雜的相互依賴作用[15]。AG490是一種酪氨酸激酶抑制劑，其能抑制STAT3信號傳導(dǎo)。本研究旨在確定STAT3是否在APAP引起肝細(xì)胞損傷后再生過程中發(fā)揮作用，通過體外實驗用APAP對小鼠正常肝細(xì)胞AML12造成損傷，加入AG490抑制STAT3通路，觀察對肝細(xì)胞增殖的影響。

本研究首先通過CCK8實驗選擇2.5 mmol/L作為APAP的處理濃度，與24 h APAP組比較，48 h APAP組細(xì)胞活力升高，說明AML12 細(xì)胞在2.5 mmol/L APAP濃度處理48 h時可能出現(xiàn)損傷后再生現(xiàn)象。RT-PCR檢測AML12 細(xì)胞中mRNA水平發(fā)現(xiàn)，24 h APAP組增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平較對照組均降低，48 h APAP組增殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平較24 h APAP組均升高，說明APAP損傷AML12細(xì)胞后48 h細(xì)胞的增殖較24 h明顯，因此本研究采用APAP 2.5 mmol/L、刺激時間48 h來模擬體外損傷AML12細(xì)胞后肝細(xì)胞再生的模型。文獻(xiàn)[16]報道，50 μmol/L的AG490能明顯下調(diào)STAT3磷酸化水平，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。此外，有研究[17]表明50 μmol/L的AG490能夠抑制宮頸鱗癌C33A細(xì)胞的增殖。故本實驗加入不同濃度AG490，CCK8結(jié)果提示50 μmol/L AG490對細(xì)胞自身活力無明顯影響，但(50 μmol/L)AG490+APAP組細(xì)胞活力較APAP組降低，因此結(jié)合CCK8結(jié)果及文獻(xiàn)最終選擇50 μmol/L AG490作為后續(xù)實驗處理濃度。PCNA是存在于真核細(xì)胞核中的一種多功能蛋白，它作為DNA復(fù)制以及DNA修復(fù)系統(tǒng)的組成部分發(fā)揮著重要作用[18]。Ki67屬于細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞分裂周期密切相關(guān)，參與細(xì)胞增殖。CyclinD1作為細(xì)胞周期進(jìn)程的積極調(diào)節(jié)者，過表達(dá)可能會加速G1/S進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。因此本研究選用PCNA、CyclinD1以及Ki67作為檢測AML12細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，同時進(jìn)一步探討AG490對APAP誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞損傷后增殖降低的可能作用通路。通過表5得出,與對照組比較， APAP組p-STAT3蛋白水平上升；與APAP組比較，APAP+AG490組p-STAT3蛋白水平下降，提示STAT3可能參與APAP損傷肝細(xì)胞后的增殖過程，而AG490通過抑制STAT3磷酸化阻斷此過程。最后通過RT-PCR及Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，加入AG490后，APAP損傷后的AML12細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA水平及蛋白表達(dá)均降低(P值均<0.01)，證實STAT3參與APAP損傷肝細(xì)胞后的增殖過程。

綜上所述，APAP誘導(dǎo)AML12細(xì)胞損傷后48 h細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，STAT3參與APAP誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞損傷后的細(xì)胞增殖，而AG490作為STAT3抑制劑通過抑制STAT3磷酸化進(jìn)一步抑制肝細(xì)胞增殖相關(guān)基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)，從而抑制APAP肝損傷后肝細(xì)胞增殖。本實驗為APAP致急性肝損傷后的治療提供理論基礎(chǔ)，同時為藥物性肝損傷的治療提供新思路。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：余旺參與課題設(shè)計，完成實驗，論文寫作；章禮久、路燕負(fù)責(zé)課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫文章，修改論文并最后定稿；宋莎莎負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析及修改論文。