高瑞雪， 胡春暉， 張發(fā)斌， 高 攀， 甘雪輝， 張耀剛， 姜博璠

1 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 西寧 810001； 2 青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧 810001

肝泡型包蟲(chóng)病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE)是由多房棘球蚴寄生人體、感染肝臟所致的慢性寄生蟲(chóng)病，在我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)流行[1-4]。治療手段以手術(shù)切除為主，但HAE的邊緣帶界限不清，術(shù)中難以完全切除，患者的復(fù)發(fā)率高達(dá)7.7%～30%[5-6]。且對(duì)于多器官轉(zhuǎn)移、晚期等無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的患者，藥物治療尤為重要。目前現(xiàn)有的治療包蟲(chóng)病的藥物如苯并咪唑類(lèi)(Benzimidazoles)藥物[7-8]主要以口服給藥為主，但給藥后毒副作用較大，肝局部藥物濃度過(guò)低[9]，療效欠佳。因此，基于HAE的生物學(xué)基礎(chǔ)，研究新型肝靶向制劑是目前治療包蟲(chóng)病的關(guān)鍵?，F(xiàn)有的肝靶向制劑的研究主要是基于粒徑效應(yīng)的注射用被動(dòng)肝靶向，但注射給藥患者依從性低，因此考慮口服肝靶向制劑。

研究[10-12]表明，頂端鈉依賴(lài)性膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(apical sodium-dependent bile acid transporter, ASBT) 是存在于回腸末端上皮細(xì)胞的一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，作為藥物吸收的潛在靶點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝細(xì)胞特異性表達(dá)的一種內(nèi)吞型受體，利用該受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)藥物或基因的肝靶向遞送[13]。ASBT、ASGPR被證實(shí)為有效的口服肝靶向制劑介導(dǎo)受體，將其應(yīng)用于HAE口服肝靶向新劑型，需驗(yàn)證二者在HAE的表達(dá)情況。因此本研究分別對(duì)HAE大鼠模型回腸組織中ASBT及肝組織中ASGPR的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析，為后期研發(fā)靶向新劑型提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性6～8周齡SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)于江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：3202781029，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(青)2016-0001。飼養(yǎng)于青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，室溫(23±2) ℃，相對(duì)濕度55%左右，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要試劑 ASBT兔多克隆抗體ab203205、ASGPR兔多克隆抗體ab42488購(gòu)于A(yíng)bcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體G23303、CY3山羊抗兔抗體GB21303購(gòu)于Servicebio公司;β-actin兔多克隆抗體AC026購(gòu)于A(yíng)Bclonal公司；Total RNA提取試劑盒、去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Takara嵌合法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司；大鼠β-actin內(nèi)參引物購(gòu)于上海生工生物工程公司。

1.3 HAE大鼠模型的建立[14]10只SD大鼠制備HAE模型。制備方法如下：解剖感染多房棘球絳蟲(chóng)的沙鼠臟器(由青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，分離包囊、洗滌、剪碎，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)原頭節(jié)活性、鏡下計(jì)數(shù)活性原頭節(jié)數(shù)量，制成含活性原頭節(jié)2000枚/μl的混懸液，備用。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉SD大鼠，劍突右下處暴露肝臟，將制備好的原頭節(jié)混懸液用無(wú)菌注射器吸取0.2 ml注射入肝臟，縫合(圖1)。造模4個(gè)月后用mindray公司的Resona7彩色多普勒超聲系統(tǒng)檢查，確認(rèn)造模是否成功。根據(jù)超聲病灶橫切面的長(zhǎng)、寬，縱切面的寬，確定病灶體積(長(zhǎng)×寬×寬)，造模成功的SD大鼠為HAE組，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 動(dòng)物分組與組織取樣 8只SD大鼠為正常對(duì)照組，8只經(jīng)超聲檢查造模成功的SD大鼠為HAE組(造模10只，成功8只)。分別取正常大鼠回腸組織、肝組織，HAE大鼠回腸組織、其他非患病肝組織、HAE大鼠肝組織病灶邊緣帶(圖1)，備用。

圖1 HAE模型大鼠的建立與肝組織取樣

1.5 免疫熒光檢測(cè) 取上述組織樣本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，并將切片浸入EDTA抗原修復(fù)緩沖液，采用微波熱修復(fù)抗原。加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，滴加BSA室溫封閉30 min。滴加0.1 mmol/L PBS稀釋好的一抗(ASBT 1∶100;ASGPR 1∶50)，4 ℃過(guò)夜孵育。滴加CY3二抗室溫避光孵育50 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核室溫避光孵育10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀(guān)察并采集圖像(DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm，發(fā)藍(lán)光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510～560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm，發(fā)紅光)。

1.6 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 組織樣本勻漿后，加RIPA裂解液提蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，以每孔蛋白上樣量15 μg配制上樣體系，煮沸變性5 min，12%SDS-PAGE恒流60 mA電泳，恒流180 mA轉(zhuǎn)膜90 min，10%脫脂牛奶封閉1 h，將PVDF膜置于稀釋的ASBT(1∶1000)、ASGPR(1∶1000)、β-actin(1∶100 000)一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PVDF膜TBST漂洗3次(每次5 min)后，以HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶10 000)為二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次(每次10 min), 將ECL顯影液均勻的覆蓋住PVDF膜表面，顯影，拍照。采用Image J進(jìn)行顯影結(jié)果的灰度值分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平 組織樣本用Total RNA提取試劑盒提取總RNA。按去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，完成總RNA反轉(zhuǎn)，得到cDNA。引物由上海生工生物工程公司合成(表1)，內(nèi)參基因選用β-actin。用Takara嵌合法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配制PCR反應(yīng)液，LightCycler480 System進(jìn)行qPCR反應(yīng)，得到目的基因與內(nèi)參基因Ct值，以2-ΔΔCt為統(tǒng)計(jì)量，計(jì)算得出目的基因的相對(duì)含量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會(huì)審批，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 HAE大鼠模型造模情況超聲檢查 對(duì)模型大鼠肝臟超聲檢查，并通過(guò)對(duì)病灶橫、縱兩個(gè)切面的檢測(cè)確定腫塊大小。超聲檢查結(jié)果顯示，肝內(nèi)不均質(zhì)腫塊，腫塊體積范圍為0.3～3.3 cm3，內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)紊亂，邊緣不規(guī)則，周邊實(shí)性部分與肝實(shí)質(zhì)分界不清，部分伴有點(diǎn)狀強(qiáng)回聲鈣化沉積(圖2)。

2.2 ASBT在HAE大鼠模型回腸組織中的表達(dá)與分布

免疫熒光鏡檢ASBT在回腸組織的分布情況顯示，ASBT在游離面和基底面細(xì)胞膜存在高表達(dá)。在HAE大鼠中，ASBT在其回腸組織中熒光強(qiáng)度高，且較正常組呈上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)(圖3，表2)；Western Blot結(jié)果分析蛋白表達(dá)水平，ASBT在HAE組表達(dá)量較正常組顯著，條帶趨勢(shì)遞增，呈現(xiàn)高表達(dá)，與免疫熒光結(jié)果趨勢(shì)一致。通過(guò)分析灰度值，HAE組表達(dá)量較正常組高(P<0.05)(圖4，表2)；分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示ASBT在HAE組較正常組表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(表2)。

注：虛線(xiàn)標(biāo)注為病灶腫塊；a，超聲檢查橫切面；b，超聲檢查縱切面；c，HAE大鼠模型肝臟感染模型圖。圖2 典型HAE模型大鼠超聲檢查及感染模型圖

注:DAPI，藍(lán)色熒光(細(xì)胞核)；CY3，紅色熒光(ASGPR陽(yáng)性表達(dá))；MERGE，疊加。圖3 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠回腸組織的表達(dá)分布(免疫熒光染色，×200)

圖4 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠回腸組織蛋白的表達(dá)水平

表2 ASBT在正常大鼠及HAE大鼠的表達(dá)比較

2.3 ASGPR在HAE大鼠模型肝組織中的表達(dá)與分布 免疫熒光鏡檢結(jié)果顯示，ASGPR在肝組織高表達(dá)，HAE組較正常組表達(dá)高，且接近病灶的部位熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(P<0.05)(圖5，表3)；Western Blot結(jié)果顯示，其在HAE組表達(dá)量較正常組顯著，條帶趨勢(shì)遞增，靠近病灶的邊緣帶表達(dá)量較非患病肝組織表達(dá)量高(P<0.05)(圖6，表3)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR mRNA相對(duì)表達(dá)量分析顯示，HAE組較正常組表達(dá)上調(diào)，趨勢(shì)與免疫熒光、Western Blot一致(P<0.05)(表3)。

圖6 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠肝組織蛋白的表達(dá)水平

表3 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠的表達(dá)比較

注:DAPI，藍(lán)色熒光(細(xì)胞核)；CY3，紅色熒光(ASGPR陽(yáng)性表達(dá))；MERGE，疊加。圖5 ASGPR在正常大鼠及HAE大鼠肝組織的表達(dá)分布(免疫熒光染色，×200)

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織治療意見(jiàn)，目前HAE的治療方式以手術(shù)切除病灶為主，并長(zhǎng)期給予苯并咪唑類(lèi)藥物[15]。由于HAE的治療時(shí)間較長(zhǎng)(1～2年)，患者大多來(lái)自農(nóng)牧區(qū)，順應(yīng)性較好的口服制劑給藥為首選給藥方式。然而，目前史可腸蟲(chóng)清(阿苯達(dá)唑片)為口服普通制劑，口服給藥后局部病灶部位藥物濃度過(guò)低是其達(dá)不到理想藥效學(xué)的主要原因[16-20]。因此，為了克服上述缺點(diǎn)，制備患者順應(yīng)性強(qiáng)、療效顯著的口服肝靶向制劑成為本課題組研究的重點(diǎn)。

研究顯示，腸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在提高某些大分子藥物，如胰島素[11]或微粒給藥系統(tǒng)[21-22]的藥物吸收速率和程度上起到了重要作用。ASBT是在回腸末端上皮細(xì)胞的頂端刷狀緣膜中高度表達(dá)的一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的溶質(zhì)載體家族，可與膽酸結(jié)合，是表達(dá)于小腸的重要載體蛋白。范未偉[11]利用ASBT設(shè)計(jì)胰島素新型口服納米載體可高效遞送胰島素，與皮下注射重組胰島素相比，胰島素的細(xì)胞攝取量較高[21]。Lozano等[22]研究證實(shí)可通過(guò)ASBT增強(qiáng)抗腫瘤藥物向膽管癌的遞送。由此可見(jiàn)，ASBT可作為轉(zhuǎn)運(yùn)受體，用于提高口服藥物的生物利用度。

ASGPR大量存在于肝細(xì)胞上且在肝外少表達(dá)，且它與包含半乳糖和N-乙酰基-半乳糖胺殘基的多個(gè)分子具有先天結(jié)合親和力[23-24]，因此ASGPR可能成為肝靶向給藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。Wang等[25]利用ASGPR與半乳糖分子的高親和性，制成負(fù)載有姜黃素的球形納米載體，明顯增強(qiáng)了姜黃素的肝臟分布。Wu等[26]基于A(yíng)SGPR-半乳糖的受體-配體相互作用構(gòu)建了糖聚合物，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)肝細(xì)胞癌治療藥物的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放。

基于A(yíng)SBT為理想的前藥轉(zhuǎn)運(yùn)體、ASGPR為肝靶向給藥系統(tǒng)的理想受體，本課題組擬通過(guò)ASBT介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)口服藥物吸收入血，藥物經(jīng)血液送達(dá)肝臟，再由肝臟高表達(dá)的ASGPR內(nèi)吞，使藥物在肝臟內(nèi)部充分釋放，進(jìn)而有效改善當(dāng)前治療藥物存在的弊端，為HAE的藥物治療提供新的可能。本研究顯示，ASBT、ASGPR在HAE組呈現(xiàn)高表達(dá)，且越接近病灶的組織，其肝細(xì)胞ASGPR表達(dá)量越高。換言之，若以ASGPR為受體的新劑型研發(fā)成功，當(dāng)其進(jìn)入HAE患者體內(nèi)，越接近病灶的組織與新劑型的結(jié)合度越高，進(jìn)而有效解決了當(dāng)前藥物肝臟局部血藥濃度較低的問(wèn)題。因此，將ASBT作為治療HAE藥物的前藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，ASGPR作為治療藥物的肝靶向給藥系統(tǒng)的受體，二者結(jié)合，可能有效解決當(dāng)前治療藥物血藥濃度低及肝臟局部血藥濃度低等問(wèn)題。本研究為后續(xù)研發(fā)治療HAE的口服靶向新劑型提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：高瑞雪、胡春暉、張發(fā)斌負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)論文，修改論文；高瑞雪、高攀、甘雪輝、張耀剛、姜博璠參與收集數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析；高瑞雪、胡春暉、張發(fā)斌負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。