焦 彥， 張 瑩， 時紅林， 盧 旺， 陳德喜， 陳 煜， 時紅波

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京市肝病研究所， 北京 100069；2 北京市肝炎與肝癌精準醫(yī)療及轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心， 北京 100069；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心四科， 肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償，其病死率為40%～60%[1]。ACLF與失代償性肝硬化的主要區(qū)別之一是肝再生潛能。一些ACLF患者雖然病情嚴重，但仍可通過肝再生存活[2]。因此，對ACLF患者開展肝再生評估，對于臨床治療選擇、預(yù)后判斷尤為重要。外泌體是一種直徑為30～100 nm的納米級脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質(zhì)[3]。外泌體在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用[4]。最新研究[5-7]表明，外泌體參與肝巨噬細胞活化和炎癥反應(yīng)以及肝細胞凋亡與增殖。ACLF時由于肝細胞大量壞死，肝臟來源的外泌體大量釋放至外周血中，因此血液中外泌體可以實時反映肝細胞的功能狀態(tài)，外泌體及其攜帶的蛋白質(zhì)有望成為ACLF臨床監(jiān)測的重要工具。本研究通過非標記(Label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對ACLF不同預(yù)后患者血漿外泌體蛋白進行鑒定和定量分析，篩選差異蛋白，通過生物信息學(xué)分析差異蛋白功能及生物學(xué)過程，為尋找ACLF預(yù)后判斷的血清學(xué)標志物及進一步探討發(fā)病機制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 前瞻性選取2019年7月—10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院的住院確診的ACLF患者10例。納入標準：年齡16～65歲，性別不限，參考《肝衰竭診治指南(2018年版)》[8]明確診斷為ACLF。排除標準：合并糖尿病、甲狀腺功能亢進；合并嚴重心、腦、腎臟疾病及其他系統(tǒng)性疾??；合并惡性腫瘤或活動性消化道出血；慢性肝衰竭；依從性差者。前瞻性入組病例，隨訪90 d，死亡或肝移植者納入肝移植/死亡組，存活者納入生存組。

1.2 主要儀器和試劑 尿素(Bio-Rad)，硫脲(Sigma-Aldrich)，蛋白定量染液(Thermo Scientific)，胰蛋白酶(AB Sciex)，超聲波細胞破碎儀(南京先歐儀器制造有限公司)，酶標儀(Thermo，Multiskan MK3)，電泳系統(tǒng)(bio-rad)，高效液相色譜儀(Thermo Scientic，EASY-nLC 1000 System)，質(zhì)譜系統(tǒng)(Thermo，Q-Exactive)，超速離心機(Beckman，OptimaTMXPN-100)。

1.3 外泌體的分離 取外周血，經(jīng)3000 r/min離心10 min獲得血漿。血漿依次經(jīng)2000 rcf離心10 min去除死細胞，10 000 rcf、4 ℃離心30 min去除細胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管，110 000 rcf、4 ℃離心70 min獲得外泌體。將獲得的外泌體懸浮于PBS溶液中，-80 ℃保存以備進一步檢測。

1.4 蛋白的提取和酶解 采集患者靜脈血5 ml，離心，分離血清，采用超速離心法提取血漿外泌體。取樣品加入適量尿素顆?；靹颍?0∶1加入蛋白酶抑制劑，超聲1 s，停1 s，累計10 s。140 00g離心30 min，提取上清液中的蛋白。BCA法測定患者蛋白水平。每例樣本取10 μg進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色30 min，脫色直至背景清晰；將每塊膠切成1 mm3小塊兒，置于1.5 ml Eppendorf管中；用 200 μl雙蒸水洗2次，每次10 min；加考染脫色液50 mmol/L NH4HCO3與ACN(1∶1)，脫色15 min，雙蒸水洗，重復(fù)，直至脫色完全；加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白，真空抽干10 min；加 10 mmol/L DTT(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；加 55 mmol/L IAA(25 mmol/L NH4HCO3溶解)200 μl，加 ACN 100 μl脫水至膠粒變白；依次用下列溶液進行混懸清洗：雙蒸水、ACN、每次10 min；將 0.01 μg/μl胰蛋白酶工作液，每管加100 μl，讓酶液與膠粒充分接觸。待酶液被膠粒完全吸收，再加25 mmol/L NH4HCO3100 μl，37 ℃過夜；離心收集酶解上清液，置于另一個Eppendorf管中。真空凍干，-20 ℃保存。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 本報告采用Orbitrap 質(zhì)譜采集液相-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MSMS)數(shù)據(jù)。配制流動相 A 液(100%水、0.1%甲酸)和 B 液(100%乙腈、0.1%甲酸)。使用A相溶解粉末，4 ℃ 14 000g離心 20 min，取上清1 μg樣品進樣，液質(zhì)檢測。液相色譜洗脫條件如表1所示。使用Q Exactive質(zhì)譜儀，Nanospray FlexTM(ESI)離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為 2.1 kV，離子傳輸管溫度為250 ℃，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質(zhì)譜全掃描范圍為 m/z 300～1400，一級質(zhì)譜分辨率設(shè)為70 000，C-trap 最大容量為3×106，C-trap 最大注入時間為 60 ms；選取全掃描中離子強度 TOP 20 的母離子使用高能碰撞裂解方法碎裂，進行二級質(zhì)譜檢測，二級質(zhì)譜分辨率設(shè)為17 500，C-trap最大容量為5×104，C-trap 最大注入時間為 80 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為 27%，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)(.raw)。

表1 液相色譜洗脫條件

1.6 蛋白的鑒定和定量分析 Label-free的質(zhì)譜分析是由Q-Exactive型質(zhì)譜系統(tǒng)完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用產(chǎn)MaxQuant軟件處理,并對蛋白質(zhì)進行鑒定和定量分析。以倍數(shù)調(diào)>1.2倍或下調(diào)>1.2倍且P<0.05為標準篩選差異蛋白質(zhì)。

1.7 生物信息學(xué)分析 通過Uniprot的注釋信息對差異蛋白進行基因功能(GO)注釋，通過Fisher精確檢驗，對差異蛋白進行功能(GO)富集分析，利用R-3.5.1軟件對差異蛋白進行層次聚類分析。

1.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會批準，批號：(2019)科研快審第(989)號?；颊呒覍僦椴⒑炇鹜鈺?/p>

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 隨訪后納入生存組患者5例，肝移植/死亡組患者5例。兩組患者在性別、年齡方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 蛋白鑒定和定量分析結(jié)果 共鑒定出4675個肽段，860種蛋白。通過定量分析，按照篩選標準共篩選出 116種差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白62種、下調(diào)蛋白54種。上調(diào)和下調(diào)最顯著的15種蛋白見表3、4 。

表3 (肝移植/死亡組)/生存組上調(diào)差異蛋白

表4 (肝移植/死亡組)/生存組下調(diào)差異蛋白

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

為了更好地解釋和剖析兩組ACLF患者血漿外泌體差異蛋白譜，對血漿差異外泌體蛋白進行注釋，同時完成生物信息學(xué)分析。

2.3.1 差異蛋白 GO 功能的富集分析結(jié)果 篩選出的 116 種差異蛋白主要參與免疫反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、細胞運動、細胞死亡、細胞增殖等重要的生物學(xué)過程，同時還與細胞質(zhì)、胞膜外區(qū)、細胞膜、質(zhì)膜、細胞核、細胞骨架、細胞液泡、核內(nèi)體等細胞組分密切相關(guān)，并具有金屬離子結(jié)合、受體結(jié)合、信號傳感器活動等分子功能(圖1)。

注：CC，細胞組分；MF，分子功能；BP，生物學(xué)過程；條形圖右側(cè)為P值。圖1 差異蛋白 GO 功能的富集分析結(jié)果

2.3.2 差異蛋白互作分析 將組間血漿外泌體差異蛋白進一步用數(shù)據(jù)庫進行互作網(wǎng)絡(luò)分析，蛋白互作關(guān)系見圖2。結(jié)果表明，鑒定到的血漿外泌體差異蛋白中有38個差異蛋白被互作網(wǎng)絡(luò)覆蓋，表明具有較好的生物學(xué)聯(lián)系，少數(shù)游離于互作網(wǎng)絡(luò)之外蛋白可能由于功能相對獨立或者與其他蛋白互作的可信度不高導(dǎo)致。KEGG 通路分析表明，差異蛋白在氨基酸的生物合成這一通路中不僅顯著性最強，且富集的蛋白數(shù)目最多(圖3)。

注：紅色圈內(nèi)表示上調(diào)表達蛋白，綠圈內(nèi)表示下調(diào)表達蛋白。圖2 蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果

3 討論

非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)近年來成為重要的質(zhì)譜定量方法，MaxQuant是目前領(lǐng)先的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量算法。本研究采用的最新一代的 Orbitrap 質(zhì)譜采集 LC-MSMS 數(shù)據(jù)，采用非標記定量結(jié)合LC/MS質(zhì)譜技術(shù)找到差異表達的外泌體蛋白質(zhì)。與其他定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比，Label-free方法的應(yīng)用范圍廣，可用于微量樣品分析，速度快，重復(fù)性好，但在進行相對定量時，低豐度蛋白不易檢測[9]。本研究共篩選出116 種外泌體差異蛋白，62種蛋白表現(xiàn)為上調(diào)、54種蛋白表現(xiàn)為下調(diào)。

在外泌體廣泛的生理作用中，以細胞間的信息交流以及物質(zhì)傳遞最為重要，外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)分子：一類為非特異性的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)在所有外泌體中，例如細胞骨架蛋白、四跨膜蛋白(CD9、CD63)和熱休克蛋白家族等；另一類為非特異性蛋白，與外泌體的細胞來源相關(guān)，蛋白的含量可能會根據(jù)疾病狀態(tài)而波動，例如B 淋巴細胞分泌的外泌體表面有 MHC-Ⅱ類分子；腫瘤細胞來源的外泌體攜帶大量腫瘤抗原，這類蛋白質(zhì)可能與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)[10-11]。

Ig是機體體液免疫應(yīng)答時B淋巴細胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)分子，在機體抵抗外來病原體中發(fā)揮著重要的作用。Ig由重鏈(H鏈，分為γ、α、μ、δ、ε鏈)和輕鏈(L鏈，分為κ型和λ型)組成。ACLF發(fā)生發(fā)展的標志是過度炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為患者血清中促炎細胞因子水平明顯升高和免疫細胞活化標志物表達上調(diào)[12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF患者存在Ig升高、補體下降及T淋巴細胞損耗。Ig、補體和T淋巴細胞計數(shù)等免疫指標的變化可反映體液免疫的應(yīng)答情況，對于判斷病情、評估預(yù)后及指導(dǎo)免疫治療具有重要意義[14]。本研究表明，外泌體中攜帶的Ig可能參與了ACLF的體液免疫，由于不同預(yù)后患者處在疾病和免疫反應(yīng)的不同階段，故表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)。在診斷ACLF時，可考慮作為血清學(xué)標志物。

在肝移植/死亡組上調(diào)的蛋白中，Drp1是蛋白質(zhì)發(fā)動蛋白超家族的成員，由GTP酶和GTP酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組成，Drp1可作用于線粒體外膜誘導(dǎo)線粒體分裂，對線粒體的分裂有重大意義[15]。抑制Drp1對幾種肝損傷模型具有保護作用，包括由毒性試劑(千里光堿和鎘)誘導(dǎo)的肝毒性損傷[16-17]、酒精誘導(dǎo)的肝毒性損傷[18]、營養(yǎng)性脂肪變性[19]和膽汁淤積性肝損傷的動物模型[20]。Diaph1是formin蛋白家族的一員，參與多種以肌動蛋白為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程，如偽足與細胞極性的形成、細胞黏附和運動等。研究[21-23]發(fā)現(xiàn)，Diaph1的基因突變與耳聾和巨血小板減少癥相關(guān)，并且癌細胞中Diaph1的表達水平與疾病的臨床分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Diaph1可使肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，促使HSC分泌腫瘤促進因子[24]。NCoR1被證明在再生或致癌過程中發(fā)揮獨特的作用，其參與脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)肝臟脂肪酸從頭合成[25]。ASL的缺乏則會導(dǎo)致慢性肝病和肝糖原代謝受損[26]。ACLF的病程中肝細胞的損傷和炎癥貫穿疾病的始終，ACLF患者血漿外泌體中的Drp1、Diaph1、NCoR1、ASL是否可以作為ACLF早期診斷的血清學(xué)標志物，尚需要做進一步的驗證。

膜聯(lián)蛋白A6是膜聯(lián)蛋白家族的一員，是一種鈣依賴性磷脂酶結(jié)合蛋白，主要存在于嚙齒動物肝細胞的質(zhì)膜。研究[27]發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A6存在于癌癥相關(guān)成纖維細胞來源的細胞外囊泡中，通過穩(wěn)定激活FAK-YAP通路誘導(dǎo)胃癌耐藥。膜聯(lián)蛋白A6還可在肝切除的肝再生模型中通過影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)，進而影響肝切除后小鼠的存活率。研究[28]發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A6基因敲除小鼠在部分肝切除后表現(xiàn)出較低的存活率，缺乏膜聯(lián)蛋白A6會損害小鼠丙氨酸依賴性糖異生和肝再生。這一發(fā)現(xiàn)與本研究中ACLF死亡組患者血漿外泌體中膜聯(lián)蛋白A6表達下調(diào)的趨勢一致。但是，對于裝載在外泌體中的膜連蛋白A6，其是否參與ACLF患者的肝再生及氨基酸合成代謝等生物過程，能否作為ACLF肝再生及預(yù)后判斷的血清學(xué)標志物，仍需進一步研究。

鐵蛋白在人體各組織中廣泛存在，目前被認為是一種腫瘤相關(guān)蛋白，其由 2 種不同的亞基構(gòu)成，分別為H鏈和L鏈，即鐵蛋白輕鏈(FTL)[29]，在血管形成、細胞增殖及免疫抑制中有重要作用[30]。鐵的過度沉積產(chǎn)生自由基，破壞肝細胞的細胞器造成肝細胞受損，并可協(xié)同病毒等外因作用引起肝功能異常、肝炎、肝硬化乃至肝癌[31]。FTL與慢性肝臟疾病密切相關(guān), 其表達水平不僅能體現(xiàn)肝損傷狀況，還能反映肝臟疾病的進展情況[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白在慢性肝病患者血清中的含量顯著高于健康人群，這主要與肝臟炎性反應(yīng)使鐵蛋白合成增加，同時肝細胞壞死導(dǎo)致鐵蛋白釋放入血有關(guān)。但是，肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中鐵蛋白輕鏈的含量均高于健康人群，但不同肝病組之間的表達可見隨病情加重逐漸降低的趨勢。ACLF患者病程中確實可見鐵蛋白的代謝異常，本研究首次在ACLF患者血漿外泌體中檢測到鐵蛋白輕鏈，其可能參與了ACLF 發(fā)病過程，其水平可能反映了疾病的進展，后續(xù)有待實驗對 FTL在慢性肝病中的表達進行分析，更好地驗證本研究結(jié)果。

綜上所述，本研究通過對ACLF患者血漿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)進行分析，篩選出116種外泌體差異蛋白，通過生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與肝臟免疫及炎癥反應(yīng)、糖類和氨基酸代謝、肝細胞損傷及再生等信號通路密切相關(guān)，從而為尋找ACLF預(yù)后判斷的血清學(xué)標志物及進一步探討發(fā)病機制提供了參考依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：焦彥負責實施研究過程和采集整理數(shù)據(jù)；張瑩、盧旺負責調(diào)研整理文獻；時紅林負責技術(shù)或材料支持；陳德喜負責修訂論文；陳煜負責患者入組及標本的收集整理；時紅波負責提出研究選題，設(shè)計研究方案以及修訂論文。