王 晨，孟玉凱，高 宇，岳偉東，張 甜，朱東陽，馬海利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

目前，除非洲豬瘟等烈性傳染病外，影響?zhàn)B豬業(yè)健康發(fā)展的主要疾病有呼吸道疾病、消化道疾病和繁殖障礙性疾病，其中，以豬呼吸道疾病危害最為嚴(yán)重[1]。引起豬呼吸道疾病的因素很多，主要包括細(xì)菌、病毒、支原體等病原體和不良飼養(yǎng)管理因素等[2]。由豬肺炎支原體（MHP）與多殺性巴氏桿菌（PM）、豬鏈球菌（SS）、副豬嗜血桿菌（HP）或豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）等呼吸道致病菌混合感染引起的肺炎稱豬地方性肺炎（Swine enzootic pneumonia）[3]。由豬肺炎支原體（MHP）與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬流感病毒（SIV）等呼吸道病毒混合感染引起的呼吸道疾病稱為豬呼吸道疾病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）[3]。

PRDC 主要發(fā)生于6～10 周齡的保育豬和13～20 周齡的育肥豬，患病豬主要表現(xiàn)為體溫升高（40 ℃以上）、食欲降低、結(jié)膜炎、呼吸困難、咳嗽、喘氣等，發(fā)病率為25%～60%，病死率為20%～90%[4]。保育豬周齡越小死亡率越高，育肥豬死亡率低，但生長發(fā)育遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。我國的廣西、福建、黑龍江等省均報(bào)道了該病的發(fā)生[5-7]，目前山西省內(nèi)PRDC 的感染狀況尚不明確。

為了調(diào)查山西省豬群中豬呼吸道疾病綜合征（PRDC） 的感染狀況，本研究利用PCR 技術(shù)對2019 年6—7 月采自山西省11 個(gè)市20 個(gè)規(guī)?；涝讏龅?21 份豬肺組織樣品進(jìn)行了PRDC 病原基因檢測，旨在為山西省防控PRDC 提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

521 份豬肺組織樣品于2019 年6—7 月采自山西省11 個(gè)市20 個(gè)規(guī)?；涝讏?，詢問、記錄生豬來源，并向當(dāng)?shù)貏?dòng)物疫控部門及相應(yīng)的養(yǎng)殖場了解疫苗免疫接種情況。

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒購自北京聚合美公司；RNA提取試劑盒購自天根生物科技公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司。

1.3 引物合成

檢測MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因的特異性引物序列源自相關(guān)參考文獻(xiàn)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 豬肺組織樣品的PCR 擴(kuò)增

無菌操作取一小塊肺組織放入滅菌的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨后，分別裝入2 個(gè)EP 管，利用試劑盒提取樣品總DNA 或RNA，并將提取的RNA經(jīng)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

利用不同病原體特異性引物并優(yōu)化相應(yīng)擴(kuò)增條件[8-12]，對提取的521 份核酸樣品進(jìn)行MHP、PRRSV、PCV2、PCV3、SIV 基因PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)PCR 擴(kuò)增目的片段的有無、大小確定檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肺組織樣品中不同病原體PCR 檢測結(jié)果

將豬肺組織樣品提取的DNA 分別利用MHP、PCV2、PCV3 特異的鑒定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)將肺組織樣品提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄后分別利用PRRSV、SIV 特異鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，部分樣品電泳結(jié)果如圖1、2 所示，利用針對不同病原體的鑒別引物可以擴(kuò)增出MHP、PCV2、PCV3 預(yù)期目的片段，但未擴(kuò)增出SIV。選取部分PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對均為相應(yīng)的病原體，因此，建立的PCR 鑒別方法可以用來區(qū)分不同病原體。

將山西省不同地區(qū)采集的521 份豬肺組織樣品分別利用針對豬呼吸系統(tǒng)綜合征不同病原體的鑒定引物進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山西省不同地市采集的豬肺臟樣品中MHP 陽性率很高，為76.9%。另外，豬圓環(huán)病毒PCV2 及PCV3 的陽性率也較高，分別為61.6%和85.2%（表2）。經(jīng)向相應(yīng)地市動(dòng)物疫控部門、豬養(yǎng)殖場管理人員進(jìn)行了解調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)刎i肺炎支原體（MHP）及豬圓環(huán)病毒（PCV2）的免疫接種率很低，很多農(nóng)戶及大型養(yǎng)殖場均未曾免疫上述疫苗，因此，MHP 和PCV2 的陽性率較高。

表2 豬肺組織樣品PRDC 病原檢測結(jié)果

2.2 山西省不同地區(qū)PRDC 的病原檢測分析

山西省11 個(gè)市MHP 陽性率均在50%以上（表3），其中，陽泉市MHP 陽性率相對較低，為50%，各市單一MHP 感染陽性率均較低，多為混合感染，各市間無顯著差異，說明山西省各地MHP 感染較為嚴(yán)重，且以混合感染為主。由MHP 與病毒混合感染情況分析（表3）可知，大同市MHP＋PVC3 的陽性率較高，為43.4%，忻州市、長治市、運(yùn)城市MHP＋PCV2＋PCV3 的陽性率均在56.4%以上，極顯著高于其他地市（P＜0.01）。MHP＋PCV2 ＋PCV3 ＋PRRSV 四重混合感染陽性率為6.1%，其中，晉城市陽性率較高，為30.2%，極顯著高于其他10 個(gè)地市（P＜0.01）。晝夜溫差變化、養(yǎng)殖環(huán)境等不良因素都容易誘發(fā)豬群的豬呼吸系統(tǒng)綜合征，不同市養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理水平和疫苗接種率不同，是造成PRDC感染率差異的主要原因。

表3 各市豬肺組織PRDC 病原檢測結(jié)果

2.3 山西省不同模式養(yǎng)豬場PRDC 的病原檢測分析

20 個(gè)規(guī)?；涝讏鲋校?4 個(gè)屠宰場的生豬來源于規(guī)?；B(yǎng)豬場，6 個(gè)屠宰場的生豬來源于當(dāng)?shù)厣B(yǎng)戶。由2 種養(yǎng)殖模式豬場PRDC 的病原檢測結(jié)果分析（表4）可知，2 種養(yǎng)殖模式下MHP 的陽性率均高于70%，但散養(yǎng)戶MHP 的陽性率為86.0%，高于規(guī)模化養(yǎng)豬場。

在豬肺炎支原體與病毒混合感染樣品中，散養(yǎng)戶MHP＋PCV2 的陽性率為8.9%，稍高于規(guī)?；B(yǎng)豬場；規(guī)?；B(yǎng)豬場MHP＋PCV3 的陽性率為26.3%，顯著高于散養(yǎng)戶；散養(yǎng)戶MHP＋PCV2＋PCV3及MHP＋PCV2＋PCV3＋PRRSV 的陽性率分別為48.6%、12.3%，均極顯著高于規(guī)模化養(yǎng)豬場。由此可知，散養(yǎng)戶由于養(yǎng)殖條件及生物安全防護(hù)不足等原因?qū)е仑i呼吸系統(tǒng)綜合征病原體的陽性率均高于規(guī)?；B(yǎng)豬場。

表4 不同養(yǎng)殖模式豬肺組織PRDC 病原檢測分析

3 結(jié)論與討論

本研究檢測的豬肺臟組織樣品采自山西省全省11 個(gè)市的20 個(gè)屠宰場，樣品來源涵蓋山西省所有地市。受非洲豬瘟期間生豬調(diào)運(yùn)政策的限制，屠宰場生豬來源多為本地養(yǎng)豬場，即采集的樣品具有一定的代表性。

山西省11 個(gè)市均可檢出MHP 陽性樣品，此次樣品采集的20 個(gè)屠宰場的生豬來源中，80%以上的養(yǎng)殖場及養(yǎng)殖戶均未免疫豬肺炎支原體弱毒苗，即MHP 利用PCR 檢測陽性具有參考價(jià)值。山西全省樣品中MHP 的陽性率為76.9%，結(jié)果與李瑩瑩[13]、邱剛等[14]報(bào)道相符。各市MHP 感染率均在50%以上，根據(jù)生豬出欄時(shí)間推測，可能與春季整體上晝夜溫差變化較大，造成豬群抵抗力下降，更容易誘發(fā)呼吸道感染有關(guān)。401 份MHP 陽性樣品中389 份為混合感染，該結(jié)果提示MHP 是引起豬呼吸道疾病綜合征的重要誘發(fā)病原。單一MHP 感染主要引起豬的慢性肺炎，并不表現(xiàn)出明顯的癥狀；當(dāng)MHP與PCV2、PRRSV、SIV 等混合感染時(shí)才會(huì)引起豬呼吸道疾病綜合征[15]。主要是由于MHP 進(jìn)入呼吸道后，破壞宿主的黏膜纖毛屏障，引起呼吸道纖毛屏障系統(tǒng)功能減退，從而繼發(fā)其他病原的感染[16]。

山西省11 個(gè)市均檢出PCV2，陽性檢出率為61.6%，劉秀清等[17]對西寧市部分地區(qū)進(jìn)行PCV2 流行病學(xué)調(diào)查，陽性率為49.94%，曹啟明等[18]對江蘇地區(qū)PCV2 進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV2 陽性率為50%，表明我國的PCV2 感染仍然較為嚴(yán)重。此次檢出的321 份PCV2 陽性樣品中，269 份均為混合感染，這與PCV2 病毒可導(dǎo)致豬的淋巴系統(tǒng)功能衰竭和免疫抑制有關(guān)。因此，豬感染PCV2 后，容易繼發(fā)其他病原的感染。PCV2＋PCV3 混合感染有較高的檢出率，與李金鳳等[19]、ZHAO 等[20]研究結(jié)果一致，推測PCV2、PCV3 之間存在某種相互作用機(jī)制，促使病毒在體內(nèi)增殖。

山西省11 個(gè)市PCV3 陽性檢出率為85.2%，原因可能是由于目前市場上尚無良好的PCV3 疫苗用于臨床預(yù)防，現(xiàn)有的PCV2 商品化疫苗對PCV3無交叉免疫保護(hù)作用，所以，PCV3 的陽性檢出率較高，且呈逐年上升的趨勢。截止目前，尚未分離培養(yǎng)出PCV3 病毒，現(xiàn)有研究僅證明PCV3 可能和豬皮炎與腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、繁殖障礙綜合征等病癥相關(guān)[21-22]，其作用機(jī)制、發(fā)病癥狀、產(chǎn)生的直接危害尚缺少數(shù)據(jù)支持。SIV 未檢出陽性樣品，這可能與采樣季節(jié)有關(guān)，豬流感易于冬春季節(jié)、天氣驟變等不良環(huán)境下多發(fā)。