劉小英，黃飛龍，劉國強(qiáng)，張游南

（福建省莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建莆田 351144）

0 引言

枇杷(Eriobotrya japonicaLindl.)，薔薇科枇杷屬植物，原產(chǎn)中國東南部，野生種質(zhì)資源極為豐富[1]。枇杷成熟于一年中最缺新鮮水果的春夏時(shí)節(jié)，正值鮮果淡季，其果實(shí)營養(yǎng)風(fēng)味佳，果肉酸甜可口，富含鈣、磷、鉀、氨基酸、胡蘿卜素等，可鮮食也可制成果脯、果醬、果酒及飲料等，其花、果、葉和根均可入藥，具止咳潤肺、清熱健胃等功效，從而深受消費(fèi)者青睞。隨著枇杷育種研究工作的不斷深入，常規(guī)育種技術(shù)難以取得較大突破，分子輔助育種應(yīng)運(yùn)而生，推動(dòng)了枇杷育種研究的進(jìn)程。目前果樹上常用的分子標(biāo)記類型有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SSR等[2-4]。ISSR是非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記，引物可以在不同物種間通用，開發(fā)成本低；克服了RAPD和RFLP許多局限性，結(jié)合了RAPD和SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，揭示的多態(tài)性較高，已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性、遺傳作圖、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中[5-9]。

近年來，基于ISSR技術(shù)的枇杷分子標(biāo)記主要集中在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳變異分析、枇杷分類研究及指紋圖譜構(gòu)建等研究方面的應(yīng)用。本文歸納總結(jié)前人研究成果，發(fā)現(xiàn)ISSR技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)越性在枇杷育種研究中得到不斷發(fā)展，但研究的深度不夠，廣度不足。功能基因的挖掘，重要農(nóng)藝性狀的QTL分析及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫的建立等深層次研究未見報(bào)道，已報(bào)道的研究也存在供試樣本量少、電泳技術(shù)落后等問題。因而筆者通過總結(jié)思考，指出存在的主要問題，提出解決的若干意見，以期為枇杷育種工作提供參考。

1 ISSR技術(shù)原理及優(yōu)缺點(diǎn)

ISSR(inter-simple sequence repeat)是1994年Zietkeiwitcz等[10]在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記。原理是根據(jù)生物廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用SSR本身設(shè)計(jì)引物，即在SSR序列的3’端或5’端加上2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，擴(kuò)增重復(fù)序列之間的基因組片段，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。ISSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)包括：操作簡(jiǎn)單、快速、高效；采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，無需DNA測(cè)序和引物設(shè)計(jì)等；引物專一性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較高；結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)物多態(tài)性豐富；呈孟德爾式遺傳。從而被廣泛應(yīng)用于杏[11-12]、梨[13-14]、葡萄[15-16]、芒果[17-21]、香蕉[22-26]等果樹遺傳育種中。ISSR標(biāo)記的不足包括：需要一定時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)PCR條件，來獲得清晰、可重復(fù)、易統(tǒng)計(jì)的條帶；ISSR是一種多基因位點(diǎn)技術(shù)，為顯性遺傳標(biāo)記，無法區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

2 ISSR技術(shù)在枇杷上的研究現(xiàn)狀

2.1 枇杷的種質(zhì)鑒定、遺傳變異分析

中國枇杷種質(zhì)資源豐富，各地之間互相引種栽培，再通過實(shí)生育種、芽變育種、雜交育種等形式選育品種，故而枇杷“同名異物或同物異名”的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。目前果樹種質(zhì)鑒定的方法，傳統(tǒng)方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定法，生化鑒定法、細(xì)胞核型分析等。傳統(tǒng)方法具有存在信息量少、取材部位有限、無法進(jìn)行早期鑒定，存在鑒定人為因素影響等局限性。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，果樹種質(zhì)鑒定由宏觀走向微觀，由復(fù)雜費(fèi)時(shí)向快速簡(jiǎn)便發(fā)展。ISSR是重要的分子標(biāo)記技術(shù)，能從分子水平揭示比較材料基因水平上的差異，因而越來越多地被用于果樹種質(zhì)鑒定工作。盛良明[27]鑒定了白沙枇杷優(yōu)良新株系‘蘇白1號(hào)’，結(jié)果表明其與‘冠玉’和‘青種’的親緣關(guān)系較近；章鎮(zhèn)等[28]根據(jù)ISSR親緣分析，推測(cè)‘冠玉’是‘白玉’和‘田中’的雜交種；趙依杰等[29]鑒定了‘東湖早’，結(jié)果表明‘東湖早’與‘太湖4號(hào)’相似系數(shù)最大；福建省農(nóng)科院選育的優(yōu)質(zhì)白肉新品種‘貴妃’、‘新白1號(hào)’和‘新白8號(hào)’形態(tài)學(xué)上相似度高，難以分辨，謝麗雪等[30]利用ISSR技術(shù)獲得可以區(qū)分三者的特異譜帶。物種的遺傳多樣性是長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果，也是其生存和發(fā)展的前提，物種群體間的遺傳多樣性越豐富，遺傳變異越多，其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性越強(qiáng)，群體的分布范圍越容易擴(kuò)大[31]。ISSR技術(shù)能提供較多的DNA片段，可掃描基因組內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)，是分析不同個(gè)體、種群、物種間遺傳差異的理想標(biāo)記。不少學(xué)者也采用ISSR分子標(biāo)記方法分析枇杷的遺傳變異。‘川早枇杷’是‘早鐘6號(hào)’的芽變新品系，梅洛銀等[32]通過對(duì)13個(gè)枇杷品種（品系）進(jìn)行ISSR分析，認(rèn)為‘川早枇杷’在遺傳物質(zhì)上發(fā)生了變異，具備成為枇杷新品種的條件；汪衛(wèi)星[33]以‘解放鐘’四倍體為母本、‘湖南早熟’二倍體為父本進(jìn)行有性雜交，對(duì)6個(gè)天然三倍體枇杷及其母本進(jìn)行ISSR分析，結(jié)果推測(cè)三倍體基因組可能主要來源于母本；孫淑霞[34]采用ISSR分子標(biāo)記探索與枇杷果肉色澤深淺有關(guān)的分子標(biāo)記及其特異片段，獲得2條差異片段，但獲得的特異片段克隆測(cè)序分析與已知色素基因沒有同源性，具體原因有待進(jìn)一步深入研究；韓雪平等[35]運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)7份供試材料的抗寒性進(jìn)行分析鑒定，除最抗寒的‘6-3-10’植株外，找到一條其他6份材料中能穩(wěn)定表達(dá)的特異條帶UBC857-600bp；楊芩等[36]采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)‘龍泉1號(hào)’、‘龍泉5號(hào)’、‘大五星’及其退化種子株系進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果從分子水平進(jìn)一步證實(shí)了枇杷退化種子株系已形成豐富的遺傳變異，遺傳背景高度復(fù)雜，是培育枇杷新品種的寶貴中間材料；杜奎等[37]以南亞枇杷與‘大五星’枇杷，南亞枇杷與4-1-5枇杷正反交真雜種為試材，綜合ISSR分析和形態(tài)學(xué)鑒定，雜交子代中個(gè)體發(fā)育形成豐富遺傳變異；張蒙蒙[38]探討EMS對(duì)枇杷潛伏芽的誘變效果，通過ISSR分析，認(rèn)為EMS處理擴(kuò)大了枇杷芽變的突變范圍，提高枇杷潛伏芽的基因突變頻率；劉丹等[39]以枇杷‘白玉’品種及其無籽芽變、‘冠玉’品種及其輻射變異為試材，通過ISSR研究發(fā)現(xiàn)兩種變異不是單一位點(diǎn)上的變異，而是發(fā)生在多個(gè)位點(diǎn)上，且實(shí)生變異＞輻射變異＞自然芽變；李靖[40]分析了在四川省阿壩州茂縣發(fā)現(xiàn)的變異植株，結(jié)果野生型和突變型之間多態(tài)性片段極少，DNA基因組背景幾乎一致，從分子水平證明突變型是野生型的芽變枝，并通過ISSR標(biāo)記找出野生型和突變型的差異片段，從分子水平為選育枇杷提供參考。

2.2 枇杷屬植物的分類研究

研究枇杷屬植物的分類、類群關(guān)系及系統(tǒng)演化，對(duì)枇杷屬植物的資源保護(hù)、遺傳改良和創(chuàng)新利用，以及新品種的培育等均具有重要意義。ISSR標(biāo)記研究枇杷屬植物的分類研究報(bào)道較少。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的王永清團(tuán)隊(duì)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)枇杷的分類研究結(jié)論如下：枇杷屬植物具有較豐富的遺傳多樣性；枇杷屬植物春季或秋冬季開花品種間無特異標(biāo)記，認(rèn)為不能以開花時(shí)期作為分類的依據(jù)；枇杷屬植物分野生類群和栽培類群，栽培類群不能按單一性狀聚類，因而認(rèn)為栽培品種的分類應(yīng)考慮多個(gè)性狀的綜合表現(xiàn)；支持大渡河枇杷是櫟葉枇杷和普通枇杷種間雜種的結(jié)論[41-46]。按自然地理來源也是枇杷屬植物傳統(tǒng)的分類方法，但謝麗雪和范付華的ISSR標(biāo)記都表明，枇杷的親緣關(guān)系與地理來源相關(guān)性不明顯。謝麗雪等[30]對(duì)24份白肉枇杷進(jìn)行ISSR技術(shù)分析，可能與枇杷栽培歷史長(zhǎng)、各地區(qū)種質(zhì)的頻繁交流、長(zhǎng)期異花授粉、變異性高等有關(guān)，供試白肉枇杷的親緣關(guān)系與地理來源相關(guān)性不明顯；范付華[47]對(duì)貴州39份野生枇杷種質(zhì)進(jìn)行ISSR技術(shù)分析，聚類結(jié)果表明與種質(zhì)表型相關(guān)，與地理來源相關(guān)性不明顯。按果肉顏色分類，枇杷可分為紅沙枇杷和白沙枇杷兩大類，而范晨昕[48]的枇杷ISSR聚類研究結(jié)果顯示，聚類結(jié)果與果肉顏色相關(guān)性不明顯。

2.3 枇杷的指紋圖譜構(gòu)建

指紋圖譜是研究動(dòng)植物群體生態(tài)與進(jìn)化、遺傳結(jié)構(gòu)、品種分類等很有價(jià)值的遺傳標(biāo)記。枇杷指紋圖譜的構(gòu)建是枇杷種質(zhì)鑒定、新品種權(quán)保護(hù)和雜交育種的重要“分子身份證”。目前枇杷的指紋圖譜構(gòu)建報(bào)道較少，已報(bào)道也是在有限的材料基礎(chǔ)上初步完成。He等[49]利用ISSR標(biāo)記構(gòu)建了‘西昌早熟’、‘早鐘6號(hào)’、‘湖南早熟’（湖南樣本、重慶樣本）、‘興寧1號(hào)’5個(gè)早熟枇杷品種（系）的指紋圖譜，；范付華等[47,50]采用ISSR標(biāo)記，應(yīng)用引物815、825和841的組合，構(gòu)建了39份貴州野生枇杷種質(zhì)的指紋圖譜，應(yīng)用引物825、834和848的組合，構(gòu)建了18個(gè)枇杷栽培品種及課題組選育的7個(gè)優(yōu)良新種質(zhì)的指紋圖譜；謝麗雪等[51]應(yīng)用SSR、SRAP、ISSR標(biāo)記技術(shù)，以枇杷‘早鐘6號(hào)’和‘貴妃’雜交的56株F1代群體為供試材料，初步構(gòu)建了含94個(gè)遺傳標(biāo)記（其中ISSR貢獻(xiàn)標(biāo)記28個(gè)），19個(gè)連鎖群的枇杷遺傳連鎖圖譜。

3 展望

近年來，隨著人類對(duì)微觀世界的不斷探索，分子標(biāo)記技術(shù)成為人類研究植物的重要技術(shù)手段。理想的分子標(biāo)記應(yīng)滿足高多態(tài)性、呈共顯性遺傳、均勻分布整個(gè)基因組、能辨別等位基因、無基因多效性，且技術(shù)的開發(fā)使用成本低、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單高效、實(shí)驗(yàn)室間可數(shù)據(jù)交換等條件。但目前已開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，無論是基于DNA雜交技術(shù)的分子標(biāo)記，基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，或是新興的第3代分子標(biāo)記，即基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記，尚不能完全滿足上述要求。因而除了不斷開發(fā)新的分子標(biāo)記，如何高效應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)手段服務(wù)于學(xué)科發(fā)展也是重要課題。因此，ISSR技術(shù)在枇杷上的應(yīng)用研究還需持續(xù)深化優(yōu)化，筆者認(rèn)為應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的工作。

（1）提高ISSR技術(shù)自身的準(zhǔn)確性。ISSR標(biāo)記技術(shù)用于枇杷種質(zhì)鑒定、枇杷分類研究及枇杷指紋圖譜的構(gòu)建，都是各研究團(tuán)隊(duì)在自身設(shè)定的供試樣本里進(jìn)行，因而如何在更大供試樣本范圍內(nèi)建立種質(zhì)特異的指紋圖譜，亟待進(jìn)一步研究。其次，已報(bào)道的枇杷ISSR標(biāo)記技術(shù)研究，均采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由于條帶較多且有些條帶大小近似，從而影響鑒別結(jié)果，如何提供靈敏度強(qiáng)、分辨率高、誤差小的電泳技術(shù)，是今后需要不斷研究的課題。

（2）延伸ISSR技術(shù)在枇杷上的研究深度和廣度。參照ISSR在其他領(lǐng)域的研究，促進(jìn)ISSR技術(shù)在枇杷育種研究上的“深度推進(jìn)”和“廣度普及”，重點(diǎn)加強(qiáng)三方面研究：一是利用ISSR分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)，縮短育種年限，提高育種質(zhì)量；二是利用ISSR標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，確定遺傳距離，弄清系譜關(guān)系，結(jié)合表型鑒定，做好枇杷分類工作；三是增加ISSR標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量，提高枇杷指紋圖譜的密度及均勻度，從而保護(hù)枇杷品種產(chǎn)權(quán)，提高枇杷種苗純度。

（3）加強(qiáng)ISSR技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。一是與其他標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。如王明強(qiáng)等采用ISSR-SCAR分子標(biāo)記快速篩選高蒼術(shù)含量的植株[52]，黃藝寧采用RAPD、ISSR分子標(biāo)記聯(lián)合鑒定毛木耳菌株的研究[53]。ISSR與其他標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，能更準(zhǔn)確揭示試驗(yàn)結(jié)果。二是結(jié)合表型分析的聯(lián)合應(yīng)用。分子標(biāo)記體現(xiàn)材料DNA水平的變異，但標(biāo)記不同、引物不同、反應(yīng)條件不同，會(huì)引起結(jié)果誤差。表型是基因與環(huán)境互作表達(dá)結(jié)果，是種質(zhì)資源研究的基礎(chǔ)。因而ISSR技術(shù)與表型分析聯(lián)合應(yīng)用，將達(dá)到更好的效果。

（4）加強(qiáng)科技協(xié)作，促進(jìn)合作交流。目前國內(nèi)關(guān)于枇杷的ISSR研究比較分散，各研究團(tuán)隊(duì)之間的合作交流較少，得出的研究成果結(jié)果可比性較差，因而構(gòu)建合作研究藍(lán)圖，形成統(tǒng)一規(guī)劃機(jī)制，利用現(xiàn)代信息技術(shù)實(shí)現(xiàn)資源共享，將在一定程度上加快ISSR技術(shù)在枇杷育種領(lǐng)域的研究。