葛蓓孛，施李鳴，張 維，楊淼泠，呂朝陽，張克誠

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

關 鍵 字：武夷菌素；生物農(nóng)藥；高產(chǎn)菌株選育；田間應用效果

化學農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲害及保障糧食豐收方面發(fā)揮著重要的作用。但是，長期及過量使用化學農(nóng)藥不僅會導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會造成農(nóng)產(chǎn)品殘留超標、環(huán)境污染等問題。因此，加速推進安全、高效且選擇性強的生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)勢在必行[1,2]。

武夷菌素是由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所研制的一種具有我國自主知識產(chǎn)權的新型生物農(nóng)藥，具有低毒、高效、廣譜、環(huán)保等特點，主要用于防治農(nóng)作物真菌病害，對白粉病、灰霉病和黑星病等效果顯著。武夷菌素先后獲得“國家重點新產(chǎn)品”證書（2000G041B326001）和有機產(chǎn)品認證（COFCC-R-0903-0070），被列入國家蔬菜病蟲害安全防治技術規(guī)范國家標準（NY/T5006-2001）和農(nóng)業(yè)行業(yè)無公害蔬菜生產(chǎn)技術規(guī)程行業(yè)標準（NY/T5074-2002），成為我國無公害蔬菜和有機蔬菜生產(chǎn)中防治病害的重要生物殺菌劑產(chǎn)品之一，為綠色植保及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出了一定的貢獻[3]。

1 產(chǎn)品創(chuàng)制

1.1 產(chǎn)生菌及分類鑒定

武夷菌素（又稱BO-10），是1979年在福建省武夷山上采集的土壤樣品中依據(jù)微生物菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性、內吸性等標準篩選到的武夷菌素原始菌種，根據(jù)菌株的形態(tài)特征和生理生化特點，進行分類鑒定并命名為不吸水鏈霉菌武夷變種Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis[4]。后期經(jīng)過分子鑒定和全基因組測序比對將其更名為小白鏈霉菌武夷變種S.albulus var.wuyiensis[5]。

1.2 理化性質及有效成分結構鑒定

武夷菌素粗制品經(jīng)Sephadex-G-25柱層析、水洗脫等方法可制備成精制品，其中有兩種不同有效成分武夷菌素a和b，其中a成分的含量占86%左右，b成分的含量為13%左右[6]。武夷菌素精制品經(jīng)冷凍干燥后為微黃色的粉末，熔點為239 ℃，易吸濕、極易溶于水、微溶于甲醇、不溶于丙酮和氯仿等有機溶劑。主效成分a通過紅外光譜、碳譜、氫譜分析，確定該組分的分子式C13H21N3O14，是一種含有胞苷骨架和過氧鍵的核苷類抗生素，經(jīng)專利局查新證明，該化合物是一種結構全新、具有自主知識產(chǎn)權的新型農(nóng)用抗生素[7]。此外，研究表明武夷菌素具有較強的抑菌活性，原因是其產(chǎn)生菌含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，已分離鑒定出的活性組分還包含納他霉素、豐加霉素、谷氏菌素、制霉菌素、ε-聚賴氨酸、苯甲酸、間苯二甲酸和黃酮類化合物等[8,9]。

1.3 作用機理

武夷菌素防治植物病原真菌的作用機制包括兩個方面，一方面武夷菌素直接抑制病原菌生長以及分生孢子萌發(fā)。武夷菌素可使病原真菌分生孢子的萌發(fā)速度和產(chǎn)孢量顯著下降，且菌絲生長變慢，分支增多、末端膨大、液泡數(shù)目增多；菌絲頂端出現(xiàn)原生質滲漏的現(xiàn)象，而芽管膨大、縊縮，影響真菌的亞細胞結構和細胞膜的滲透性；干擾菌絲體蛋白質、核酸及細胞壁幾丁質的正常合成，從而起到抑菌的作用。另一方面，武夷菌素通過啟動防御反應的相關信號途徑，提高植物體內防御相關酶（如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶）的活性，進而提高植物自身的抗病性[9-11]。

1.4 毒性及安全性評價

武夷菌素的急性毒性試驗結果為LD50＞10 g/kg體質量，屬于相對無毒。蓄積毒性系數(shù)＞5，故無明顯蓄積性。武夷菌素對大鼠最大無作用劑量為5000 mg/kg，無致畸、致突變效應。武夷菌素各項指標均符合國家衛(wèi)生標準。

武夷菌素對環(huán)境生物的毒性和安全性評估結果為，蜜蜂LD50（48 h）＞5000 mg/mL；家蠶LD50（2齡）＞3226 mg/kg；斑馬魚LD50（96 h）＞89.92 mg/mL；鵪鶉LD50（7 d）＞100 mg/kg根據(jù)國家農(nóng)藥對環(huán)境生物的毒性及風險性分級標準，武夷菌素對蜂、蠶、鳥、魚均為低毒[6]。

1.5 產(chǎn)品登記

通過極性溶劑與穩(wěn)定劑篩選、多孔性載體吸附能力比較和助劑增效配伍等一系列技術措施，創(chuàng)制出1%水劑、2%水劑和3%可溶性粉劑武夷菌素系列產(chǎn)品（農(nóng)藥登記證號：LS981038、LS20083112。其中1%水劑獲得農(nóng)藥生產(chǎn)批準證書，在中國 20多個省市（自治區(qū)）蔬菜、果樹等作物上應用，推廣應用超過 200萬hm2。

2 高產(chǎn)菌株選育

2.1 傳統(tǒng)育種技術

開展選育遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)優(yōu)良菌株是提高菌株單位效價，降低生產(chǎn)成本，提升武夷菌素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平和提高產(chǎn)品競爭力的關鍵環(huán)節(jié)。前期，采用傳統(tǒng)的物理和化學誘變技術、原生質體融合等育種方法，獲得了一系列在武夷菌素產(chǎn)量上比原始菌株有大幅提升的高產(chǎn)菌株。利用60Co-γ-射線和中子照射的M35和M46突變體作為親本進行原生質體融合，選擇營養(yǎng)標記互補的穩(wěn)定的原養(yǎng)型重組子，獲得高產(chǎn)菌株F31-24，效價比出發(fā)菌株提高了約80%[6]。以L7為出發(fā)菌株，采用不同劑量（500 Gy、1000 Gy和1500 Gy）的60Coγ-射線進行輻照誘變，成功選育遺傳穩(wěn)定性良好的菌株C-75，其效價較出發(fā)菌株提高34.4%。采用低能碳離子注入的方法，獲得高產(chǎn)菌株F64（菌種保藏號CGMCC No.1967），效價可提高到6643 μg/mL，是出發(fā)菌株的2.5～3倍，發(fā)酵時間可縮短5～10 h[3]。傳統(tǒng)育種雖能有效選育武夷菌素高產(chǎn)菌株，但存在隨機性大、費時費力、易回復突變甚至還可能引入不利突變，無法實現(xiàn)精準的定向選育。

2.2 分子育種技術

基因工程育種相比傳統(tǒng)育種具有專一性強、育種周期短、不易產(chǎn)生回復突變等優(yōu)點，能夠有效彌補傳統(tǒng)育種的不足。近年來，已完成武夷菌素產(chǎn)生菌的全基因組測序，克隆武夷菌素生物合成基因簇，成功建立了高效遺傳轉化體系，解析武夷菌素生物合成途徑及其關鍵調控機制[12]。研究表明，武夷菌素生物合成基因簇，包括22個結構基因和6個調控基因。其中，通過增加正調控基因wysR基因的表達量，可顯著提高武夷菌素產(chǎn)量，發(fā)酵效價達到7215 μg/mL，較出發(fā)菌株提高26.5%[13]。由于微生物在次級代謝過程中往往受多個基因協(xié)調控制，單個基因的缺失可能會由其他基因在功能上進行互補，因此單基因的遺傳操作具有一定的局限性。通常菌株體內含有復雜的代謝系統(tǒng)，很多同類型基因簇對前體的利用是相同的，因此他們之間存在相互作用[3]。武夷菌素產(chǎn)生菌中含有谷氏菌素、豐加霉素、制霉菌素、納他霉素等其他活性成分。通過強啟動子kasO*p強啟動cluster5谷氏菌素生物合成基因簇的轉運基因gouM，獲得的菌株發(fā)酵液中武夷菌素產(chǎn)量較原始菌株提高了34.1%[14]。此外，通過敲除豐加霉素生物合成基因中影響武夷菌素產(chǎn)量的toyG和toyF基因，構建的toyF基因缺失突變株和toyG基因缺失突變株武夷菌素產(chǎn)量較野生菌株分別提高了23.06%和18.28%[15]。

3 發(fā)酵及提取工藝

采用響應面法優(yōu)化了菌株F64的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，利用菌株F64和優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，將有機碳源、有機氮源、速效碳源、無機氮源、無機鹽以及水和菌株F64加入到發(fā)酵罐中，在28 ℃條件下進行二級發(fā)酵。培養(yǎng)條件為：一級發(fā)酵時間30～36 h，二級發(fā)酵時間48～56 h，接種量5%，罐壓0.10 MPa，通氣量1:0.9，攪拌轉速180 r/min。采用高產(chǎn)菌株F64和優(yōu)化的培養(yǎng)基配方發(fā)酵生產(chǎn)武夷菌素，節(jié)約發(fā)酵成本20%～30%[16]。

武夷菌素濃縮提取通常采用傳統(tǒng)的薄膜蒸發(fā)法，但該方法會導致武夷菌素分解，收率僅為70%～80%。根據(jù)武夷菌素的結構特征（分子量443），設計發(fā)明了一種以人工生物膜為材料的“三膜組合”的濃縮提取方法，其原理是精濾膜和超濾膜分別去除分子量大于1500和800的大分子化合物，納濾膜可截留分子量為 150～800的化合物，去除水分、無機鹽等小分子物質?！叭そM合”法可在常溫下濃縮提取武夷菌素，收率高達95%，不破壞武夷菌素的活性，且降低能耗、工藝簡便，實現(xiàn)低碳生產(chǎn)[17]。

4 田間推廣應用效果

武夷菌素對蔬菜、果樹、糧食和經(jīng)濟作物真菌病害有很好的防效，如對白粉病、灰霉病、霜霉病、黑星病、枯萎病、流膠病、腐爛病等均有很高的防效，同時還具有一定的增產(chǎn)作用。

4.1 蔬菜病害的防治

武夷菌素對各種作物白粉病特別是黃瓜白粉病防效可達90%以上，防效與化學農(nóng)藥粉銹寧和百菌清相當。利用武夷菌素防治番茄葉霉病的防效穩(wěn)定，能達到85%左右，防效超過化學農(nóng)藥速克靈和撲海因以及生物農(nóng)藥春雷霉素和多抗霉素。此外，武夷菌素對番茄灰霉病也具有較好的防治效果，其防效在 80%以上，好于化學農(nóng)藥速克靈，且武夷菌素和多抗霉素配合使用防效更佳[18,19]。

4.2 糧食作物病害的防治

利用武夷菌素防治大豆灰斑病防效可達到97.12%，同時，武夷菌素對大豆炭疽病、菌核病也具有良好的防效[20,21]。在四川蒲江進行的田間試驗表明，武夷菌素對小麥白粉病的防效達到84.7%，略低于25%粉銹寧90.7%的防效，且武夷菌素對小麥葉銹病也有一定防效。此外，武夷菌素在控制玉米紋枯病中具有重要的應用潛力，其對玉米紋枯病生長具有顯著的影響，菌落直徑減少 75%以上，菌絲致病力下降99%[22]。

4.3 經(jīng)濟作物病害的防治

武夷菌素防治花卉病害，特別是月季花白粉病，效果理想，在黑龍江省大慶市和深圳的田間試驗中，防效在85%左右；防治蘆筍莖枯病效果明顯，防效在80%以上；對茶樹上的炭疽病、白星病、油菜菌核病、根腐病、白粉病等均有良好防效。利用武夷菌素防治西瓜枯萎病防效達 69.0%～85.7%，同時對西瓜炭疽病防效也較好。利用1%武夷菌素水劑200倍浸種24 h＋500倍噴根2次處理，能夠有效地控制棉花黃萎病的發(fā)生，防治效果達到83.33%，顯著好于多菌靈[3,23,24]。

4.4 果樹病害的防治

武夷菌素對柑橘流膠病、瘡痂病、潰瘍病防效可達 90%～100%，同時對柑橘炭疽病、腳腐病、煤污病、樹脂病也有很好的防效[3]。在老果園連續(xù)5年應用生物農(nóng)藥武夷菌素防治蘋果腐爛病，其平均防效達86.2%，高出腐必治的防效 34%。它還是很好的防腐保鮮劑，對蘋果、桃、梨、枇杷、葡萄、獼猴桃、龍眼、荔枝等水果上的真菌性病害均有很好的防效。利用 2%武夷菌素水劑對新疆厚皮甜瓜白粉病進行田間防效試驗發(fā)現(xiàn)其防效達到60.17%。此外，武夷菌素對草莓白粉病、灰霉病、葡萄白粉病、霜霉病、白腐病等也有良好防效[3,25-27]。

5 展望

經(jīng)過多年的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應用，武夷菌素已成為我國無公害蔬菜生產(chǎn)中防治真菌病害的重要生物農(nóng)藥產(chǎn)品之一。隨著全社會食品安全和環(huán)境安全意識的增強，武夷菌素作為一種高效、廣譜的生物農(nóng)藥，具有廣闊的發(fā)展前景。但在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中也存在許多問題，如需要重新辦理正式登記、不斷提高菌株效價、優(yōu)化發(fā)酵工藝、研發(fā)更高效的提取工藝、創(chuàng)新武夷菌素產(chǎn)品新劑型及完善田間應用技術等。

今后研究工作將主要集中在以下幾個方面：（1）加快推進正式登記辦理。依據(jù)2017年修訂后的《農(nóng)藥管理條例》相關要求，完善登記所需的毒理、殘留、代謝等技術報告，盡快完成正式登記，繼續(xù)為農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)做貢獻。（2）提高菌株效價及優(yōu)化發(fā)酵工藝?；趥鹘y(tǒng)育種，綜合利用基因工程和代謝工程技術，選育高產(chǎn)菌株，同時改進發(fā)酵工藝，實現(xiàn)各種發(fā)酵技術參數(shù)優(yōu)化組合，從根本上降低武夷菌素的生產(chǎn)成本，促進產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。（3）研發(fā)高效活性成分的提取技術?；诨钚猿煞值睦砘匦?，通過選擇合適的柱材，組合高效分離制備、濃縮凍干技術等，并結合高效液相色譜，不斷提高有效成分的含量，為研制武夷菌素產(chǎn)品新劑型奠定基礎。（4）創(chuàng)新武夷菌素產(chǎn)品的新劑型。武夷菌素產(chǎn)品多為水劑形式，存在運輸及儲藏不便的缺點；武夷菌素粉劑產(chǎn)品中含有一定的糖分，儲存過程中容易潮解結塊。因此，需要進一步開發(fā)可濕性粉劑、顆粒劑、生物種衣劑、微膠囊劑等，提高儲存時化學性質穩(wěn)定性，降低加工和儲運成本，提高藥劑與作物黏附性，節(jié)約藥劑施用的人力成本等。（5）建立武夷菌素的配套應用技術。針對不同作物和防治對象，開展包括最佳施藥時期、施藥濃度、施藥間隔期及與其他生物防治產(chǎn)品配套使用的綜合防控技術，解決單一生物農(nóng)藥難以在作物生長栽培周期防控多種病蟲害的問題。