張方艷，童 芳，劉美伶，韓守建，朱桂蘭

(合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥 230601)

柑橘類水果在熱帶、亞熱帶等許多地區(qū)都有廣泛種植，年產(chǎn)量約為1.02億噸，是全球最重要的經(jīng)濟作物之一，也是世界第一大類水果[1]。柑橘在我國南方廣泛種植，是南方最重要的經(jīng)濟果樹之一[2]，截至2019年，我國柑橘產(chǎn)量達4584.5萬噸[3]。柑橘中含有黃烷酮、酚酸、檸檬苦素、L-抗壞血酸、類胡蘿卜素、揮發(fā)性萜烯等多種生物活性化合物[4]。因此，橘類水果具有顏色亮麗、香氣怡人、口感酸甜、營養(yǎng)豐富等特點，受到全世界消費者的喜愛。隨著我國柑橘產(chǎn)量的逐年增加，我國的人均鮮果消費已明顯高于世界平均水平，存在總量過剩、結(jié)構性過剩、季節(jié)性過剩、低品質(zhì)類型過剩等問題，難以滿足消費者日益多元化、個性化的需求[3]。解決這一問題的關鍵就是對柑橘進行深加工。

目前，柑橘加工產(chǎn)品有橘子罐頭、果醬、橘子果汁、橘子果酒等，其中柑橘果汁和果酒的加工都需要榨汁，但柑橘在經(jīng)過榨汁、殺菌、貯藏等加工環(huán)節(jié)后會出現(xiàn)苦味增強的現(xiàn)象，影響柑橘汁或酒的口感，導致產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟價值下降，消費者可接受度降低，制約了柑橘果汁和果酒加工業(yè)的發(fā)展[5]。雖然柑橘酒中含有豐富的VA和VC，對增強免疫力、維持機體機能有重要作用[6]，同時還含有豐富的礦物質(zhì)元素[7]，但對其研究一直停留在試驗階段。令其無法像葡萄酒一樣進入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的原因主要來源于其加工后產(chǎn)生的“后苦味”，這類苦味物質(zhì)嚴重影響了柑橘酒的口感，因此，對柑橘酒進行脫苦是柑橘酒發(fā)展的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，造成口感苦澀的原因是柑橘中自帶的柚皮苷[8]，所以去除柚皮苷就成了釀造柑橘酒的關鍵步驟。目前常用的脫苦方法有酶法脫苦、遮蔽法脫苦和吸附法脫苦等[9]。本實驗利用酶法對柑橘酒進行發(fā)酵前后脫苦，對比脫苦效果，并優(yōu)化脫苦工藝，為改進柑橘酒脫苦技術提供一定的理論支持，以期改善柑橘酒的品質(zhì)，推動柑橘酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料及試劑

柑橘：廣西皇帝柑。

食品級柚苷酶，江蘇鑫瑞生物科技；果膠酶，綠城食化；亞硫酸鈉，廈門墨奕懷食品有限公司；二甘醇，華勝化工；柚皮苷(標準品)，成都麥德生科技有限公司。

1.1.2 試驗設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇杰瑞爾電器有限公司；FA2004B型電子分析天平，上海市安亭電子儀器廠；九陽JYL-C051型榨汁機，九陽有限股份公司；V-5100B可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；阿貝折光儀，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柚皮苷標準曲線的制備

參考戴維斯法[10]，稍有改動。以吸光值A和柚皮苷標準品的量(mg)來制作柚皮苷標準曲線：A=2.1994X+0.093，R2=0.9984。

1.2.2 柑橘酒的釀造工藝

原料→挑選→去皮去核→破碎榨汁→添加果膠酶處理→添加酵母發(fā)酵→倒酒，澄清→得到柑橘酒。

1.2.3 脫苦處理

考察柚苷酶加入時期對脫苦效果的影響。(1)發(fā)酵前直接對橘子汁進行脫苦處理，即向100mL橘子汁中加入不同量的柚苷酶，在40℃水浴反應30 min，酶解完成后接種酵母發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束測定酒液中柚皮苷含量。(2)對發(fā)酵后的橘子原酒液進行脫苦處理，即向100mL橘子原酒液中加入不同量的柚苷酶，在40℃水浴反應30 min，酶解完成測定酒液中柚皮苷含量。柚苷酶添加量分別為0.02 g、0.04 g、0.06 g、0.08 g、0.10 g。

1.2.4 柚苷酶單因素實驗

對橘子原酒進行酶解脫苦的單因素實驗，考察酶解的pH(3、4、5、6、7)、酶解溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、酶解時間(20 min、40 min、60 min、80 min、100 min)對脫苦效果的影響，結(jié)合脫苦率及感官評價，確定單因素最佳水平。

1.2.5 柚苷酶脫苦條件優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上以pH值、酶解溫度、酶解時間最佳水平設計正交試驗。具體見表1。

表1 正交試驗因素及水平表

1.2.6 柑橘酒發(fā)酵前后柚皮苷含量的測定以及脫苦率的計算

參考李利君[11]等人的測量方法，使用可見光分光光度計，在420 nm波長處用二甲醇和氫氧化鈉混合液作為顯色液與柚皮苷發(fā)生顯色反應，測量其吸光度值。通過柚皮苷標準曲線標線確定其中柚皮苷的含量。

脫苦率用去除柚皮苷的程度來表示，計算公式為

式中D為脫苦率(%)，C為脫苦前柚皮苷含量(mg/mL)，C1為脫苦后柚皮苷含量(mg/mL)。

1.2.7 柑橘酒的感官評價以及評分

參考蔣燕明等人[12]的感官評價方法，稍有改動，柑橘酒的感官評分表見表2。

表2 柑橘酒感官評價表

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2010、SPSS 22及Origin2019等軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚苷酶加入時期及其添加量對于脫苦效果的影響

探究柚苷酶加入時期對效果的影響，結(jié)果如圖1和圖2。從兩圖橫向觀察，酶添加量0.2 g/L～0.6 g/L時，脫苦率和感官評分隨著酶添加量的增加而增加；當酶添加量達到0.6 g/L時脫苦能力最大，此時對發(fā)酵前果汁進行酶處理的脫苦率為62.2%，對發(fā)酵后原酒進行酶處理的脫苦率77.3%；酶添加量超過0.6 g/L時，脫苦能力趨于穩(wěn)定。由兩圖縱向?qū)Ρ瓤芍?，同一酶濃度下，對發(fā)酵后原酒進行脫苦的效果明顯優(yōu)于發(fā)酵前對果汁進行的脫苦效果。原因可能是發(fā)酵后柚皮苷被充分釋放，更有利于柚苷酶將其去除。在進行感官評定時發(fā)現(xiàn)，當酶添加量超過0.6 g/L時，酒液的口感會隨著酶添加量的增加而變差。因此，選擇對發(fā)酵后原酒進行柚苷酶脫苦，且酶添加量為0.6 g/L為宜。

圖1 柚苷酶發(fā)酵前添加和發(fā)酵后添加對脫苦率的影響

圖2 柚苷酶的添加時期和添加量對感官評分的影響

2.2 單因素對于脫苦效果的影響

2.2.1 pH值對于脫苦效果的影響

探究pH值對于脫苦效果的影響，結(jié)果如圖3。由圖3可知，脫苦率隨著pH值3～7先降低后增加，這可能是因?qū)嶒炈玫蔫周彰笧榛旌厦?，即為真菌來源和細菌來源的混合柚苷酶，真菌來源的柚苷酶在酸性條件下更穩(wěn)定，而細菌來源的柚苷酶更適合偏中性的環(huán)境條件。因此，在pH3.0和pH7.0時能最大地發(fā)揮柚苷酶的活性，使之最大限度地作用于柚皮苷，增加酶與底物的反應速度。在上述2個條件下脫苦率分別為83.56%、81.38%。但進行感官評價時發(fā)現(xiàn)pH3.0時酒液口感不好，因為酒液酸度過高影響了酒液的口感，感官評分僅61.43分，而pH7.0的感官評分為78.63分。綜合考慮，選用pH7.0作為本實驗酶反應的最適pH。

圖3 pH對脫苦效果的影響

2.2.2 酶反應時間對于脫苦效果的影響

探究酶解時間對于脫苦效果的影響，結(jié)果如圖4。從圖4可知，酶解時間對脫苦率影響不明顯，只有在酶解60 min時脫苦率稍高，之后趨于穩(wěn)定。在進行感官評價時發(fā)現(xiàn)幾組酒液在口感上的差距較小，很難區(qū)別出更好。所以酶解時間對脫苦效果影響較小，暫定酶解時間60 min為宜。

圖4 反應時間對脫苦效果的影響

2.2.3 反應溫度對于脫苦效果的影響

探究酶解溫度對于脫苦效果的影響，結(jié)果如圖5。酶解溫度在30℃～50℃范圍時，脫苦效果隨著溫度的升高而增大，當酶解溫度在50℃時，脫苦效果最好，脫苦率為65.26%，感官評分73.43分。當酶解溫度超過50℃后，脫苦效果隨著溫度的上升而降低。原因可能是溫度升高，酶蛋白結(jié)構發(fā)生變性而導致柚苷酶活性降低或喪失，從而脫苦能力降低[14]。因此，選擇酶解溫度為50℃。

圖5 酶解溫度對脫苦效果的影響

2.3 正交試驗確定最佳脫苦條件

在單因素試驗基礎上確定脫苦處理選擇在發(fā)酵后對原酒進行酶處理，酶添加量為0.6 g/L。按照pH值、反應溫度、反應時間最佳水平設計正交試驗[13]。柑橘酒脫苦工藝優(yōu)化試驗結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 正交試驗結(jié)果和直觀分析表

表4 正交試驗方差分析表

由極差R可知，影響脫苦效果的因素依次是pH值>酶解溫度>酶解時間，即柚苷酶反應的最佳pH對脫苦效果影響最大，影響最小的是酶解時間。由均值可得最優(yōu)組合是A3B2C3，既是pH值為7、酶解溫度50℃、酶解時間為60 min，在此條件下對柑橘原酒進行柚苷酶脫苦處理效果最好。

由方差分析可知pH值和酶解溫度的P值小于0.05，說明pH值和酶解溫度對于柚苷酶脫苦效果具有顯著性。酶解時間的P值大于0.05，說明其對于柚苷酶脫苦效果的影響不顯著。

2.4 驗證實驗

根據(jù)正交試驗確定的實驗組合A3B2C3即pH值為7、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，按照該條件對100 mL柑橘原酒進行脫苦處理，加入0.06 g的柚苷酶并調(diào)整pH到7，在50℃水浴反應60 min，反應結(jié)束后測量其脫苦率。并對正交試驗的9組酒液和驗證組的酒液進行感官評價。結(jié)果見表5。

表5 感官評價表

由表5可知，酒液的脫苦率與感官評分成正比關系。未脫苦處理的原酒液口感苦澀無法下咽，在經(jīng)過脫苦處理后口感有著明顯的提升。而驗證組的脫苦率達到了64.05%,高于其他組，相應的感官評分也遠高于其他組，達到了81.26分。說明實驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本實驗采用酶法對柑橘酒進行脫苦處理，考察柚苷酶的加入時期和添加量對脫苦效果的影響，同時優(yōu)化脫苦條件對脫苦效果的影響。實驗結(jié)果表明：發(fā)酵后對原酒液進行酶脫苦處理的效果要優(yōu)于發(fā)酵前對鮮榨柑橘汁進行酶脫苦處理，同時柚苷酶最適添加量為0.6 g/L；正交試驗優(yōu)化的最佳脫苦條件即pH7、酶解溫度50℃、酶解時間60 min，在此條件下處理的橘子原酒，脫苦率為64.05%，感官評分81.26分。試驗結(jié)果表明，柑橘酒經(jīng)柚苷酶脫苦處理方法可行，不僅改善了酒體的苦味，還提升了酒體的品質(zhì)，為柑橘酒的制備工藝改良提供理論參考。