陶原 田春梅

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 256600

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性的X染色體隱性遺傳病，由營養(yǎng)不良蛋白基因突變導(dǎo)致營養(yǎng)不良蛋白缺乏［1-2］。在兒童早期發(fā)病，其特征是近端肌肉無力和小腿肥大。患者通常在12歲喪失下肢行動能力，并在十幾歲至二十多歲時死于心肺并發(fā)癥［3］。目前尚沒有特效藥物，且發(fā)病機制研究不明確，本綜述描述了DMD的臨床特征，臨床表現(xiàn)和治療方法，以及一些新型療法的研究。

1 發(fā)病機制

DMD是由DMD基因突變引起的。DMD基因編碼肌營養(yǎng)不良蛋白，位于肌細胞膜和肌動蛋白絲表面之間的肌細胞內(nèi)，其mRNA主要在骨骼、心臟、平滑肌和大腦中表達［4］。該基因可發(fā)生各種突變，如缺失（60%～65%）、重復(fù)（5%～10%）和點突變［5］。DMD基因突變的影響主要取決于變異是否破壞了這些突變下游的閱讀框。在框外突變的情況下，DMD基因的開放閱讀框被破壞從而導(dǎo)致DMD。同時，框內(nèi)突變并形成異常但保留部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白則引起貝克肌營養(yǎng)不良癥［6］。由于突變類型的不同，骨密度表型可能有很大的變化，從無癥狀到邊緣性DMD［6］。有研究表明，LTBP4和SPP1基因多態(tài)性的表達對患兒發(fā)病年齡有影響［7］。肌營養(yǎng)不良蛋白是連接肌動蛋白細胞骨架和細胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，有助于支持肌肉的力量和功能。缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白會導(dǎo)致肌肉纖維中肌漿蛋白的丟失和肌肉的廣泛損傷，從而導(dǎo)致肌肉退化。此外，DMD肌纖維逐漸被脂肪和纖維化組織所取代，這進一步阻礙了肌肉的機械和生理活動［8］。

肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏導(dǎo)致肌肉纖維變性的確切機制仍不清楚。質(zhì)膜上肌營養(yǎng)不良蛋白的缺乏會導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白從膜上脫離，導(dǎo)致細胞骨架破裂，從而導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定性和對機械應(yīng)力的敏感性增加。涉及肌肉損傷的各種機制包括機械損傷、細胞內(nèi)鈣水平增加、信號分子的損傷和免疫細胞的增加等［9］。

2 臨床表現(xiàn)

DMD患者通常從近端開始出現(xiàn)進行性肌無力。典型表現(xiàn)為肌肉無力、步態(tài)改變、肌肉假性肥大和行走困難?；加蠨MD的男孩通常在沒有用糖皮質(zhì)激素治療的前提下在10～12歲之間失去行走能力，隨著病情的發(fā)展，許多患者由于缺乏椎旁肌肉支持而發(fā)展為脊柱側(cè)凸，從而影響呼吸，上肢功能在后一階段下降。其他骨科并發(fā)癥包括長骨骨折、骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)攣縮癥（通常首先出現(xiàn)在腳踝，然后出現(xiàn)在臀部、膝蓋、肘部和腕部）。也有認知障礙、注意力缺陷多動障礙、自閉癥譜系障礙和強迫癥的報道。擴張型心肌病通常在10歲以后出現(xiàn)，隨著年齡的增長，DMD患者呼吸和心臟問題繼續(xù)惡化，最終導(dǎo)致其死亡［10］。

3 治 療

3.1 糖皮質(zhì)激素 迄今為止，皮質(zhì)類固醇（如潑尼松龍、潑尼松）已成為唯一在DMD中有效的藥物。皮質(zhì)類固醇改善DMD強度的具體機制尚不清楚，但目前包括改變肌肉纖維中基因的調(diào)節(jié)、減慢骨骼肌分解速度、減少細胞毒性T細胞、降低胞質(zhì)鈣濃度和增加成肌細胞修復(fù)。有研究結(jié)果表明，潑尼松龍、潑尼松可以在10 d內(nèi)改善肌肉力量，3個月藥效達最大，并可以維持18個月，且可降低呼吸系統(tǒng)與心臟功能及脊柱側(cè)彎患病率和嚴重性。但還沒有長期的隨機對照試驗表明，皮質(zhì)類固醇會延長DMD患者失去活動能力的時間或改善長期生存率。其不良反應(yīng)包括體質(zhì)量增加、行為改變、免疫抑制和多毛癥，少部分可出現(xiàn)骨折、青春期延遲、高血壓、白內(nèi)障及生長抑制［11-12］。

3.2 上調(diào)肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白 Utrophin蛋白是6號染色體編碼的常染色體同源物，與肌營養(yǎng)不良蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似［13］。在mdx小鼠（DMD模型）和金毛獵犬MD（一種DMD的狗模型）中，utrophin蛋白的上調(diào)已顯示出有效的結(jié)果［14］。有研究表明，ezutromid使用utrophin A啟動子片段在預(yù)防m(xù)dx小鼠的進展過程中具有積極作用，并減少了再生纖維的數(shù)量［15］，但有一項臨床2期試驗表明其缺乏持續(xù)療效［16］。目前正在開發(fā)第2代內(nèi)啡肽調(diào)節(jié)劑，特別是SMT022357被發(fā)現(xiàn)在mdx小鼠中表現(xiàn)出體內(nèi)有效性，導(dǎo)致骨骼肌和心肌中肌營養(yǎng)因子的表達增加。目前已有研究表明，相對于ezutromid，SMT022357更能有效改善mdx小鼠的營養(yǎng)不良表型［17］。

3.3 核因子抑制劑 核因子κB（NF-κB）的激活可以導(dǎo)致肌肉蛋白降解，從而產(chǎn)生促炎性介質(zhì)，如細胞因子和趨化因子，導(dǎo)致疾病發(fā)展。DMD患者可見到活化的NF-κB。edasalonexent（CAT-1004）是一種口服小分子，設(shè)計為抑制NF-κB，目前處于1/2期臨床試驗中。該藥物處于臨床試驗第一階段，該藥物被證明對DMD患者安全且耐受良好，但是有報道稱在治療12周后，未能顯示出明顯獲益［19］。在一項為期1周的針對男孩的1期試驗中的第一階段，也耐受性良好，目前需要下一步試驗［18］。

脂聯(lián)素也可以降低NF-κB的活性，對暴露于急性和慢性炎癥的骨骼肌具有抗炎作用。之前在一項mdx小鼠的實驗中證明了脂聯(lián)素基因的局部給藥降低了骨骼肌中幾種氧化應(yīng)激及炎性標(biāo)志物的表達，并增加了肌源性標(biāo)志物的表達，可以延緩疾病進展，通過減少肌肉發(fā)炎、損傷來改善肌肉及力量［20］。

3.4 肌肉生長抑制素抑制劑 肌肉生長抑制素（myostatin）是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的成員，是骨骼肌質(zhì)量的負調(diào)控因子。mdx小鼠模型中肌生成抑制素的丟失或抑制可導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加、力量增強、脂肪替代減少和纖維化。domagzumab與myostatin結(jié)合并抑制其活性，在實驗中顯示安全且耐受性良好，但近期一項2期臨床試驗未取得良好結(jié)果［21］。ACE-031是激活蛋白IIB型和IgG1-Fc的融合蛋白，結(jié)合肌生長抑制素和相關(guān)配體，在一項臨床實驗中由于其肌肉相關(guān)的不良事件最終導(dǎo)致終止研究［22］。胰島素生長因子1有助于肌肉生長，目前正在臨床試驗中研究其在增加肌肉纖維大小方面的用途。

3.5 基因治療

3.5.1 外顯子跳躍 通常是指使用合成反義寡核苷酸抑制剪接增強子位點，以防止特定外顯子參與剪接。從而將DMD轉(zhuǎn)化為貝克肌營養(yǎng)不良癥，其目的是閱讀框的恢復(fù)以及部分功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生，而不是非功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生［23］。13%～14%的DMD患者有可能通過跳過第51外顯子糾正閱讀框的缺失。eteplirsen可與肌營養(yǎng)不良蛋白前體mRNA的外顯子51結(jié)合，并在mRNA加工過程中導(dǎo)致外顯子51被跳躍。它是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的首個跳過外顯子的藥物（2016年9月），一項meta分析表明eteplirsen還可以改善患者呼吸功能，但尚無長期證據(jù)表明他們的長期療效［24］。drisapersen和suvodirsen也已在臨床試驗中進行過評估，但由于的risapersen的不良反應(yīng)（蛋白尿及血小板減少）及suvodirsen（肌營養(yǎng)不良蛋白并未增加）效果不佳，其臨床開發(fā)已停止。針對第53外顯子，golodirsen治療的患者的肌肉活檢顯示，外顯子53跳躍增加，有肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生［25］。viltolarsen也顯示安全且有療效，但仍需要進一步研究［26］。對于外顯子45跳躍，casimersen的療效也正有一項臨床試驗進行研究［27］。

3.5.2 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD患者基因組中插入外源DMD基因，從而表達出有作用的肌營養(yǎng)不良蛋白。由于肌營養(yǎng)不良蛋白基因的分子量大和病毒載體相對攜帶較少，需要創(chuàng)建微型肌營養(yǎng)不良蛋白基因進行傳遞。重組腺相關(guān)病毒載體用于攜帶微量和小型營養(yǎng)蛋白。這種療法在mdx小鼠中顯示出成功的結(jié)果，但在一項臨床試驗中，患兒出現(xiàn)了嚴重的免疫反應(yīng)［28］。最近，研究顯示，微肌營養(yǎng)不良蛋白的交貨使用AAV載體可以減少在DBA/2J-mdx小鼠，對于DMD嚴重mdx小鼠的骨骼肌炎癥和纖維化，但該療法尚未經(jīng)過臨床測試［29］。

3.5.3 提前終止密碼子通讀 提前終止密碼子通讀是指當(dāng)提前終止密碼子（Ptc）位于DMD基因的編碼區(qū)域時，就會發(fā)生無義突變，翻譯過程被迫終止，導(dǎo)致功能失調(diào)的肌營養(yǎng)不良蛋白形式被截斷［30］。通過多項體外研究闡明，慶大霉素等氨基糖苷類藥物可成功抑制多種不同MRNA中PTCs的翻譯終止，恢復(fù)哺乳動物細胞中相關(guān)蛋白的生理功能。其不良作用包括如耳毒性、腎毒性［31］。但氨基糖苷類有優(yōu)先與線粒體核糖體結(jié)合的特性，目前研究采用較低毒性雜交脂質(zhì)體包裹的慶大霉素能有效恢復(fù)mdx小鼠骨骼肌中肌營養(yǎng)不良蛋白的表達，適合長期抑制治療［32］。此外，一種非氨基糖苷類抗生素已被證實能抑制哺乳動物細胞中的Ptc。negamycin是一種肽類抗生素，修復(fù)mdx小鼠骨骼肌和心肌的肌營養(yǎng)不良，比慶大霉素的毒性更?。?3］。另一個Ptc抑制基因是ataluren，廣泛的臨床前研究表明，ataluren安全可用，比抗生素具有更特定的功能（不影響脫靶部位，如溶酶體膜）。然而對于其療效現(xiàn)仍有爭議，目前需要進一步研究證明［34］。

3.5.4 基因編輯 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在mdx小鼠和犬體內(nèi)進行基因編輯，可見骨骼肌和心肌中肌營養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)，并伴有肌膜上DGC成分的重新定位和骨骼肌功能的改善。CRISPR/Cas9技術(shù)基組水平上模擬外顯子跳躍效應(yīng)，恢復(fù)DMD開放閱讀框，并生成擁有部分功能的營養(yǎng)不良蛋白。通過CRISPR/Cas9技術(shù)，在去除mdx小鼠中突變的22、23外顯子實驗和在缺失DMD基因44和50外顯子小鼠的實驗中，取得了很好的療效［34］。

3.6 干細胞治療 干細胞治療是基于異體或自體的細胞移植，其目的是再生患者受損的組織或器官，并補充特定的干細胞群。在DMD的情況下，主要的目標(biāo)是用肌營養(yǎng)不良蛋白感受態(tài)細胞重建衛(wèi)星細胞池，從而由于表達肌纖維的肌營養(yǎng)不良蛋白存在而恢復(fù)肌肉功能。細胞來源可以來自自體或者供體［35］。目前研究的人類細胞治療方法可根據(jù)技術(shù)和/或使用的細胞的性質(zhì)分為3類：⑴部分或完全分化的細胞，⑵胚胎干細胞，⑶誘導(dǎo)多能干細胞。部分或完全分化的細胞此組包括肌衛(wèi)星細胞，骨骼肌醛脫氫酶陽性細胞，間充質(zhì)干細胞和間血管細胞和CD133+細胞。將成肌細胞移植到免疫抑制的mdx小鼠后，看到了可喜的成果。但由于免疫反應(yīng)，在一項男童的試驗中并未成功［14］。但在一項mdx小鼠實驗中，源于系統(tǒng)性抗肌萎縮蛋白表達嵌合細胞成功移植了成肌細胞DEC和間充質(zhì)干細胞，結(jié)果顯示有心肌功能的改善［36］。

有研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)（一種融合到dCas9中的轉(zhuǎn)錄激活因子）可以靶向并精確重塑內(nèi)源性O(shè)ct4或Sox2基因位點，使修飾后的細胞系有效地向多能細胞重編程，這表明基因編輯和干細胞療法相結(jié)合有望成為DMD的新療法［37-38］。

4 總 結(jié)

DMD是一種破壞性疾病，其特征在于進行性肌無力，是由于缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白引起的，在早期階段，受影響的肌肉會經(jīng)歷無數(shù)次損傷和修復(fù)循環(huán)，但在后期階段，會逐漸被脂肪和纖維化組織所替代。目前尚無DMD的治愈方法，糖皮質(zhì)激素是唯一已被證明能將運動障礙延遲1～2年的藥物。目前許多藥物在動物實驗中顯示有效，但在人類中成果不明顯，還需進一步研究，但是在干細胞治療及基因治療中顯示出巨大研究、治療前景。現(xiàn)階段對DMD進行的研究，對未來其治療提供了前進的方向。