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        杜氏肌營養(yǎng)不良癥的研究進展

        2021-04-17 23:11:10陶原田春梅
        關(guān)鍵詞:外顯子骨骼肌干細胞

        陶原 田春梅

        濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,山東 256600

        杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一種致死性的X染色體隱性遺傳病,由營養(yǎng)不良蛋白基因突變導(dǎo)致營養(yǎng)不良蛋白缺乏[1-2]。在兒童早期發(fā)病,其特征是近端肌肉無力和小腿肥大。患者通常在12歲喪失下肢行動能力,并在十幾歲至二十多歲時死于心肺并發(fā)癥[3]。目前尚沒有特效藥物,且發(fā)病機制研究不明確,本綜述描述了DMD的臨床特征,臨床表現(xiàn)和治療方法,以及一些新型療法的研究。

        1 發(fā)病機制

        DMD是由DMD基因突變引起的。DMD基因編碼肌營養(yǎng)不良蛋白,位于肌細胞膜和肌動蛋白絲表面之間的肌細胞內(nèi),其mRNA主要在骨骼、心臟、平滑肌和大腦中表達[4]。該基因可發(fā)生各種突變,如缺失(60%~65%)、重復(fù)(5%~10%)和點突變[5]。DMD基因突變的影響主要取決于變異是否破壞了這些突變下游的閱讀框。在框外突變的情況下,DMD基因的開放閱讀框被破壞從而導(dǎo)致DMD。同時,框內(nèi)突變并形成異常但保留部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白則引起貝克肌營養(yǎng)不良癥[6]。由于突變類型的不同,骨密度表型可能有很大的變化,從無癥狀到邊緣性DMD[6]。有研究表明,LTBP4和SPP1基因多態(tài)性的表達對患兒發(fā)病年齡有影響[7]。肌營養(yǎng)不良蛋白是連接肌動蛋白細胞骨架和細胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分,有助于支持肌肉的力量和功能。缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白會導(dǎo)致肌肉纖維中肌漿蛋白的丟失和肌肉的廣泛損傷,從而導(dǎo)致肌肉退化。此外,DMD肌纖維逐漸被脂肪和纖維化組織所取代,這進一步阻礙了肌肉的機械和生理活動[8]。

        肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏導(dǎo)致肌肉纖維變性的確切機制仍不清楚。質(zhì)膜上肌營養(yǎng)不良蛋白的缺乏會導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白從膜上脫離,導(dǎo)致細胞骨架破裂,從而導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定性和對機械應(yīng)力的敏感性增加。涉及肌肉損傷的各種機制包括機械損傷、細胞內(nèi)鈣水平增加、信號分子的損傷和免疫細胞的增加等[9]。

        2 臨床表現(xiàn)

        DMD患者通常從近端開始出現(xiàn)進行性肌無力。典型表現(xiàn)為肌肉無力、步態(tài)改變、肌肉假性肥大和行走困難?;加蠨MD的男孩通常在沒有用糖皮質(zhì)激素治療的前提下在10~12歲之間失去行走能力,隨著病情的發(fā)展,許多患者由于缺乏椎旁肌肉支持而發(fā)展為脊柱側(cè)凸,從而影響呼吸,上肢功能在后一階段下降。其他骨科并發(fā)癥包括長骨骨折、骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)攣縮癥(通常首先出現(xiàn)在腳踝,然后出現(xiàn)在臀部、膝蓋、肘部和腕部)。也有認知障礙、注意力缺陷多動障礙、自閉癥譜系障礙和強迫癥的報道。擴張型心肌病通常在10歲以后出現(xiàn),隨著年齡的增長,DMD患者呼吸和心臟問題繼續(xù)惡化,最終導(dǎo)致其死亡[10]。

        3 治 療

        3.1 糖皮質(zhì)激素 迄今為止,皮質(zhì)類固醇(如潑尼松龍、潑尼松)已成為唯一在DMD中有效的藥物。皮質(zhì)類固醇改善DMD強度的具體機制尚不清楚,但目前包括改變肌肉纖維中基因的調(diào)節(jié)、減慢骨骼肌分解速度、減少細胞毒性T細胞、降低胞質(zhì)鈣濃度和增加成肌細胞修復(fù)。有研究結(jié)果表明,潑尼松龍、潑尼松可以在10 d內(nèi)改善肌肉力量,3個月藥效達最大,并可以維持18個月,且可降低呼吸系統(tǒng)與心臟功能及脊柱側(cè)彎患病率和嚴重性。但還沒有長期的隨機對照試驗表明,皮質(zhì)類固醇會延長DMD患者失去活動能力的時間或改善長期生存率。其不良反應(yīng)包括體質(zhì)量增加、行為改變、免疫抑制和多毛癥,少部分可出現(xiàn)骨折、青春期延遲、高血壓、白內(nèi)障及生長抑制[11-12]。

        3.2 上調(diào)肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白 Utrophin蛋白是6號染色體編碼的常染色體同源物,與肌營養(yǎng)不良蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似[13]。在mdx小鼠(DMD模型)和金毛獵犬MD(一種DMD的狗模型)中,utrophin蛋白的上調(diào)已顯示出有效的結(jié)果[14]。有研究表明,ezutromid使用utrophin A啟動子片段在預(yù)防m(xù)dx小鼠的進展過程中具有積極作用,并減少了再生纖維的數(shù)量[15],但有一項臨床2期試驗表明其缺乏持續(xù)療效[16]。目前正在開發(fā)第2代內(nèi)啡肽調(diào)節(jié)劑,特別是SMT022357被發(fā)現(xiàn)在mdx小鼠中表現(xiàn)出體內(nèi)有效性,導(dǎo)致骨骼肌和心肌中肌營養(yǎng)因子的表達增加。目前已有研究表明,相對于ezutromid,SMT022357更能有效改善mdx小鼠的營養(yǎng)不良表型[17]。

        3.3 核因子抑制劑 核因子κB(NF-κB)的激活可以導(dǎo)致肌肉蛋白降解,從而產(chǎn)生促炎性介質(zhì),如細胞因子和趨化因子,導(dǎo)致疾病發(fā)展。DMD患者可見到活化的NF-κB。edasalonexent(CAT-1004)是一種口服小分子,設(shè)計為抑制NF-κB,目前處于1/2期臨床試驗中。該藥物處于臨床試驗第一階段,該藥物被證明對DMD患者安全且耐受良好,但是有報道稱在治療12周后,未能顯示出明顯獲益[19]。在一項為期1周的針對男孩的1期試驗中的第一階段,也耐受性良好,目前需要下一步試驗[18]。

        脂聯(lián)素也可以降低NF-κB的活性,對暴露于急性和慢性炎癥的骨骼肌具有抗炎作用。之前在一項mdx小鼠的實驗中證明了脂聯(lián)素基因的局部給藥降低了骨骼肌中幾種氧化應(yīng)激及炎性標(biāo)志物的表達,并增加了肌源性標(biāo)志物的表達,可以延緩疾病進展,通過減少肌肉發(fā)炎、損傷來改善肌肉及力量[20]。

        3.4 肌肉生長抑制素抑制劑 肌肉生長抑制素(myostatin)是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的成員,是骨骼肌質(zhì)量的負調(diào)控因子。mdx小鼠模型中肌生成抑制素的丟失或抑制可導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加、力量增強、脂肪替代減少和纖維化。domagzumab與myostatin結(jié)合并抑制其活性,在實驗中顯示安全且耐受性良好,但近期一項2期臨床試驗未取得良好結(jié)果[21]。ACE-031是激活蛋白IIB型和IgG1-Fc的融合蛋白,結(jié)合肌生長抑制素和相關(guān)配體,在一項臨床實驗中由于其肌肉相關(guān)的不良事件最終導(dǎo)致終止研究[22]。胰島素生長因子1有助于肌肉生長,目前正在臨床試驗中研究其在增加肌肉纖維大小方面的用途。

        3.5 基因治療

        3.5.1 外顯子跳躍 通常是指使用合成反義寡核苷酸抑制剪接增強子位點,以防止特定外顯子參與剪接。從而將DMD轉(zhuǎn)化為貝克肌營養(yǎng)不良癥,其目的是閱讀框的恢復(fù)以及部分功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生,而不是非功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生[23]。13%~14%的DMD患者有可能通過跳過第51外顯子糾正閱讀框的缺失。eteplirsen可與肌營養(yǎng)不良蛋白前體mRNA的外顯子51結(jié)合,并在mRNA加工過程中導(dǎo)致外顯子51被跳躍。它是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的首個跳過外顯子的藥物(2016年9月),一項meta分析表明eteplirsen還可以改善患者呼吸功能,但尚無長期證據(jù)表明他們的長期療效[24]。drisapersen和suvodirsen也已在臨床試驗中進行過評估,但由于的risapersen的不良反應(yīng)(蛋白尿及血小板減少)及suvodirsen(肌營養(yǎng)不良蛋白并未增加)效果不佳,其臨床開發(fā)已停止。針對第53外顯子,golodirsen治療的患者的肌肉活檢顯示,外顯子53跳躍增加,有肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生[25]。viltolarsen也顯示安全且有療效,但仍需要進一步研究[26]。對于外顯子45跳躍,casimersen的療效也正有一項臨床試驗進行研究[27]。

        3.5.2 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD患者基因組中插入外源DMD基因,從而表達出有作用的肌營養(yǎng)不良蛋白。由于肌營養(yǎng)不良蛋白基因的分子量大和病毒載體相對攜帶較少,需要創(chuàng)建微型肌營養(yǎng)不良蛋白基因進行傳遞。重組腺相關(guān)病毒載體用于攜帶微量和小型營養(yǎng)蛋白。這種療法在mdx小鼠中顯示出成功的結(jié)果,但在一項臨床試驗中,患兒出現(xiàn)了嚴重的免疫反應(yīng)[28]。最近,研究顯示,微肌營養(yǎng)不良蛋白的交貨使用AAV載體可以減少在DBA/2J-mdx小鼠,對于DMD嚴重mdx小鼠的骨骼肌炎癥和纖維化,但該療法尚未經(jīng)過臨床測試[29]。

        3.5.3 提前終止密碼子通讀 提前終止密碼子通讀是指當(dāng)提前終止密碼子(Ptc)位于DMD基因的編碼區(qū)域時,就會發(fā)生無義突變,翻譯過程被迫終止,導(dǎo)致功能失調(diào)的肌營養(yǎng)不良蛋白形式被截斷[30]。通過多項體外研究闡明,慶大霉素等氨基糖苷類藥物可成功抑制多種不同MRNA中PTCs的翻譯終止,恢復(fù)哺乳動物細胞中相關(guān)蛋白的生理功能。其不良作用包括如耳毒性、腎毒性[31]。但氨基糖苷類有優(yōu)先與線粒體核糖體結(jié)合的特性,目前研究采用較低毒性雜交脂質(zhì)體包裹的慶大霉素能有效恢復(fù)mdx小鼠骨骼肌中肌營養(yǎng)不良蛋白的表達,適合長期抑制治療[32]。此外,一種非氨基糖苷類抗生素已被證實能抑制哺乳動物細胞中的Ptc。negamycin是一種肽類抗生素,修復(fù)mdx小鼠骨骼肌和心肌的肌營養(yǎng)不良,比慶大霉素的毒性更?。?3]。另一個Ptc抑制基因是ataluren,廣泛的臨床前研究表明,ataluren安全可用,比抗生素具有更特定的功能(不影響脫靶部位,如溶酶體膜)。然而對于其療效現(xiàn)仍有爭議,目前需要進一步研究證明[34]。

        3.5.4 基因編輯 使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在mdx小鼠和犬體內(nèi)進行基因編輯,可見骨骼肌和心肌中肌營養(yǎng)不良蛋白恢復(fù),并伴有肌膜上DGC成分的重新定位和骨骼肌功能的改善。CRISPR/Cas9技術(shù)基組水平上模擬外顯子跳躍效應(yīng),恢復(fù)DMD開放閱讀框,并生成擁有部分功能的營養(yǎng)不良蛋白。通過CRISPR/Cas9技術(shù),在去除mdx小鼠中突變的22、23外顯子實驗和在缺失DMD基因44和50外顯子小鼠的實驗中,取得了很好的療效[34]。

        3.6 干細胞治療 干細胞治療是基于異體或自體的細胞移植,其目的是再生患者受損的組織或器官,并補充特定的干細胞群。在DMD的情況下,主要的目標(biāo)是用肌營養(yǎng)不良蛋白感受態(tài)細胞重建衛(wèi)星細胞池,從而由于表達肌纖維的肌營養(yǎng)不良蛋白存在而恢復(fù)肌肉功能。細胞來源可以來自自體或者供體[35]。目前研究的人類細胞治療方法可根據(jù)技術(shù)和/或使用的細胞的性質(zhì)分為3類:⑴部分或完全分化的細胞,⑵胚胎干細胞,⑶誘導(dǎo)多能干細胞。部分或完全分化的細胞此組包括肌衛(wèi)星細胞,骨骼肌醛脫氫酶陽性細胞,間充質(zhì)干細胞和間血管細胞和CD133+細胞。將成肌細胞移植到免疫抑制的mdx小鼠后,看到了可喜的成果。但由于免疫反應(yīng),在一項男童的試驗中并未成功[14]。但在一項mdx小鼠實驗中,源于系統(tǒng)性抗肌萎縮蛋白表達嵌合細胞成功移植了成肌細胞DEC和間充質(zhì)干細胞,結(jié)果顯示有心肌功能的改善[36]。

        有研究發(fā)現(xiàn),利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統(tǒng)(一種融合到dCas9中的轉(zhuǎn)錄激活因子)可以靶向并精確重塑內(nèi)源性O(shè)ct4或Sox2基因位點,使修飾后的細胞系有效地向多能細胞重編程,這表明基因編輯和干細胞療法相結(jié)合有望成為DMD的新療法[37-38]。

        4 總 結(jié)

        DMD是一種破壞性疾病,其特征在于進行性肌無力,是由于缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白引起的,在早期階段,受影響的肌肉會經(jīng)歷無數(shù)次損傷和修復(fù)循環(huán),但在后期階段,會逐漸被脂肪和纖維化組織所替代。目前尚無DMD的治愈方法,糖皮質(zhì)激素是唯一已被證明能將運動障礙延遲1~2年的藥物。目前許多藥物在動物實驗中顯示有效,但在人類中成果不明顯,還需進一步研究,但是在干細胞治療及基因治療中顯示出巨大研究、治療前景。現(xiàn)階段對DMD進行的研究,對未來其治療提供了前進的方向。

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