張冬冬，李 芮，劉曉明

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種常見的間質(zhì)性肺疾病，以成纖維細(xì)胞的過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的生成降解失衡導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)破壞為主要病理特征，臨床上具有發(fā)病原因不明、致死致殘率高、慢性進(jìn)行性加重、不可逆等特點(diǎn)。本病預(yù)后差，經(jīng)確診后平均存活年限為3～5年，5年存活率只有20%[1]。近年來，國(guó)內(nèi)外大量研究顯示，肺纖維化發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2]，已成為全球關(guān)注的亟待解決的人類健康問題。

當(dāng)前西醫(yī)針對(duì)PF的治療藥物主要有吡非尼酮和尼達(dá)尼布，另外常規(guī)治療手段為抗炎聯(lián)合免疫抑制劑，但僅可延緩肺纖維化的進(jìn)展，緩解癥狀，并不能改善病灶[3]。因此醫(yī)學(xué)界大量學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥。有研究基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ兴幹委煼卫w維化用藥規(guī)律分析后發(fā)現(xiàn)黃芪出現(xiàn)頻率最高[4]，針對(duì)黃芪治療肺纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行篩選，黃芪存在20種相關(guān)有效活性成分及457個(gè)相應(yīng)作用靶點(diǎn)，且僅一種有效成分即可作用于多個(gè)具有不同功能的基因，發(fā)揮抗肺纖維化作用，這充分說明黃芪可多靶點(diǎn)-多途徑發(fā)揮不同功能抑制肺纖維化[5-6]。筆者分析總結(jié)了黃芪治療肺纖維化的作用機(jī)制，旨在為后續(xù)的研究提供具有針對(duì)性的研究思路。

1 抑制炎癥反應(yīng)

炎癥細(xì)胞在肺纖維化發(fā)生、進(jìn)展過程中起到了至關(guān)重要的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，肺纖維化早期以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡炎癥為主，繼而出現(xiàn)成纖維細(xì)胞增生，晚期以纖維化改變?yōu)橹鱗7]。炎癥細(xì)胞主要有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，其中以巨噬細(xì)胞為主，它可分泌多種促纖維化的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β等，還可通過介導(dǎo)信號(hào)途徑參與肺纖維化的發(fā)生[8-9]。

研究[10]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可在大鼠肺纖維化早期降低白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，延緩肺纖維化進(jìn)展。朱茜文等[11]研究證實(shí)黃芪多糖還可降低肺纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6濃度，減輕肺纖維化。細(xì)胞焦亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的需要憑借半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）進(jìn)行的細(xì)胞死亡方式，是炎癥反應(yīng)的重要途徑之一。王鵬飛等[12]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可降低特發(fā)性肺纖維化小鼠Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平，減少細(xì)胞焦亡，抑制肺組織炎癥反應(yīng)，降低炎細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能降低炎癥反應(yīng)，抑制肺纖維化[13]。黃芪總皂苷、黃芪多糖、黃芪總黃酮均可抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的炎癥反應(yīng)，減少炎細(xì)胞聚集，其中黃芪總黃酮抗炎效果最為明顯，炎癥反應(yīng)強(qiáng)度和纖維化程度呈正比，聯(lián)合用藥可提高療效[14]。

參與PF發(fā)展過程的巨噬細(xì)胞主要有肺泡巨噬細(xì)胞（AM）和肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IM）兩類，兩者在肺纖維化不同進(jìn)展時(shí)期向M1型和M2型轉(zhuǎn)化。M1型可在炎癥初期清除病原體，加快炎癥進(jìn)展；M2型在晚期肺纖維化階段抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)纖維化降解[15]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃芪水提物可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，抑制其向M2型轉(zhuǎn)化[16]。

2 協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激系統(tǒng)功能

氧化應(yīng)激時(shí)氧化/抗氧化平衡失調(diào)，以氧化功能亢進(jìn)為主，可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和組織損傷。肺組織長(zhǎng)期暴露于較高濃度的氧環(huán)境中，對(duì)氧化應(yīng)激具有高敏感性，當(dāng)體內(nèi)氧自由基大量累積或抗氧化能力不足時(shí)氧化應(yīng)激便會(huì)被激活，此時(shí)肺組織將不可避免地發(fā)生損傷、修復(fù)及重構(gòu)[17]。臨床研究[18]表明，肺纖維化患者體內(nèi)存在異常的氧化活性。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過強(qiáng)的氧化能力可加速肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，氧化應(yīng)激的過度激活被認(rèn)為是PF的重要發(fā)病機(jī)制之一。

劉建等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過升高肺組織中GSH水平和降低MDA水平，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化能力，達(dá)到治療肺纖維化的目的。王增霞[20]通過體外研究得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能明顯提高人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）內(nèi)Nrf2轉(zhuǎn)錄激活，上調(diào)MRC-5細(xì)胞內(nèi)各抗氧化指標(biāo)SOD、CAT、GSH，以及相關(guān)抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表達(dá)水平，降低氧化損傷指標(biāo)MDA水平，認(rèn)為黃芪甲苷是通過干預(yù)Nrf2/ARE信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮抗纖維化作用。歐陽(yáng)燕等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可通過逆轉(zhuǎn)肺纖維化小鼠體內(nèi)異常升高的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、血清丙二醛/總抗氧化能力比值（MDA/T-AOC）、NADPH氧化酶2（NOX2）、NOX4、超氧化物歧化酶3（SOD3）mRNA轉(zhuǎn)錄水平，抑制肺纖維化。欒智華等[22]研究發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白也具有改善肺組織抗氧化的能力，主要表現(xiàn)在其能降低肺纖維化小鼠肺組織中TGF-β1、MDA表達(dá)水平，上調(diào)SOD表達(dá)水平。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可在肺纖維化形成晚期調(diào)節(jié)NO代謝，增強(qiáng)肺組織抗氧化能力，維護(hù)肺纖維化大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的正常形態(tài)。

3 激活細(xì)胞自噬、抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

自噬是指細(xì)胞自我吞噬、降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，以達(dá)到自身的代謝需求或完成某些細(xì)胞器的更新過程。大量研究表明，肺纖維化過程中p62及自噬體數(shù)量增加，LC3B、自噬相關(guān)重要基因（Beclin1、Atg14）表達(dá)減少[24]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是一個(gè)上皮細(xì)胞失去細(xì)胞黏附、基底極性，而獲得間充質(zhì)遷移、侵襲和產(chǎn)生ECM特性的生物學(xué)過程。目前這一過程的常見標(biāo)志包括上皮細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白（E-caderin）丟失，間充質(zhì)標(biāo)記蛋白波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等升高，這些標(biāo)志在肺纖維化中均可被檢測(cè)到[25]。自噬和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中均占據(jù)緊要地位。近年來自噬與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的交互關(guān)系成為眾學(xué)者探究的焦點(diǎn)。徐存來等[26]研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)肺纖維化小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的自噬水平可抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論得到了有效證實(shí)，苗雙等[27]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IPF中的EMT過程抑制或激活水平與細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)或抑制水平呈正比。因此激活細(xì)胞自噬，抑制EMT過程可作為肺纖維化的重要治療靶點(diǎn)。EMT可由多條信號(hào)通路調(diào)控，其中主要的包括TGF-β1/Smads信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等[28]。

韓佳等[29]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷可抑制TGF-β1信號(hào)通路下游Smad3蛋白合成，逆轉(zhuǎn)肺纖維化小鼠肺組織中EMT相關(guān)標(biāo)志性蛋白（α-SMA、E-caderin）的表達(dá)。徐昌君等[30]研究了黃芪總黃酮抗肺纖維化的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路上游miRNA-21基因的表達(dá)激活，調(diào)節(jié)下游Smad7、Smad3、α-SMA的表達(dá)水平，阻礙TGF-β1/Smads信號(hào)通路，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。黃芪多糖也具有相同的作用機(jī)制[11]。研究證實(shí)黃芪注射液可通過下調(diào)TGF-β1，抑制肺組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[31]。

ZHOU Y等[32]采用黃芪注射液腹腔注射干預(yù)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Jagged-1、Notch1表達(dá)水平均降低，表明黃芪注射液能通過抑制Notch信號(hào)通路Notch受體及其配體Jagged-1表達(dá)，阻礙上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，減輕肺纖維化。

王鵬飛等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以提高肺纖維化小鼠肺組織LC3Ⅱ蛋白表達(dá)，降低p62蛋白沉淀，激活自噬抑制肺纖維化。黃霂晗等[33]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷抑制肺纖維化作用與降低肺組織中α-SMA及膠原蛋白表達(dá)，減少成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。王鵬飛等[12]的研究和黃霂晗等[33]的研究均針對(duì)單個(gè)細(xì)胞因子，未對(duì)相關(guān)信號(hào)通路展開研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較單一。徐昌君等[34]對(duì)此進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷作用于mTOR相關(guān)信號(hào)通路，除了可干預(yù)LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)外，還能下調(diào)TGF-β1表達(dá)，提高Beclin-1表達(dá)，抑制p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-m TOR/m TOR表達(dá)，降低α-SMA表達(dá)水平，升高E-caderin表達(dá)水平。因此，黃芪甲苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)肺組織細(xì)胞自噬活性，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，延緩肺纖維化進(jìn)程。杜全宇等[35]對(duì)黃芪多糖治療肺纖維化機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究后發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖也可作用于mTOR信號(hào)通路，降低肺組織中mTOR蛋白及其所在信號(hào)通路下游效應(yīng)蛋白p-S6、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白α-SMA表達(dá)，抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少肌成纖維細(xì)胞的增殖分化，減輕肺纖維化程度。欒智華等[36]研究證實(shí)黃芪糖蛋白可抑制肺組織中α-SMA蛋白生成干預(yù)肺纖維化，實(shí)驗(yàn)未對(duì)α-SMA蛋白所在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行深入研究。目前關(guān)于黃芪糖蛋白治療肺纖維化作用機(jī)制的研究較少，待進(jìn)一步跟進(jìn)。

除此3種誘導(dǎo)EMT常見信號(hào)通路外，于競(jìng)澤[37]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用黃芪總皂苷對(duì)肺纖維化模型進(jìn)行干預(yù)后，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化水平明顯降低，各細(xì)胞中自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量明顯升高，自噬相關(guān)蛋白（LC3B-Ⅱ）表達(dá)及自噬相關(guān)基因（Beclin-1、ATG5、ATG7）mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)膠原（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）沉積明顯減少，同時(shí)利用生物抑制劑進(jìn)行Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)后證實(shí)，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路活化水平與肺成纖維細(xì)胞自噬呈負(fù)相關(guān)。因此黃芪總皂苷可抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，激活肺成纖維細(xì)胞自噬，進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，延緩肺纖維化。

4 維持基質(zhì)金屬蛋白酶系平衡

細(xì)胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)的大量堆積是肺纖維化的主要病理特征之一。大量研究表明，ECM的過量沉積與基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的比例失調(diào)密切相關(guān)。MMPs是一組主要降解ECM的鋅離子依賴酶群，在正常狀態(tài)下，活性水平較低，當(dāng)肺組織發(fā)生纖維化或炎癥時(shí)，MMPs活化水平明顯提升，其中包括有PF抑制作用的MMP-1、MMP-19等，旨在降解ECM，減少膠原蛋白的合成，但也有對(duì)PF起促進(jìn)作用的MMP-7、MMP-9等，可激活上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和纖維細(xì)胞遷移，這些抗纖維化和促纖維化介質(zhì)之間的平衡遭到破壞后，導(dǎo)致異常修復(fù)過程[38-40]，出現(xiàn)肺纖維化。

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的特異性內(nèi)源抑制因子，它以1∶1的比例與MMPs的活性位點(diǎn)相結(jié)合降低其活性。有研究指出，MMP-9/TIMP-1＞1時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)具有降解ECM效應(yīng)，阻止纖維化的發(fā)生，而當(dāng)比值＜1時(shí)則處于纖維化進(jìn)展期[41]，正常肺組織中兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。張千一等[42]研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1均升高，且MMP-9/TIMP-1比例發(fā)生失衡，用藥干預(yù)后兩者比例得到改善，肺纖維化進(jìn)程亦得以延緩。因此調(diào)控MMPs、TIMPs的表達(dá)，維持MMPs/TIMPs的穩(wěn)態(tài)平衡可抑制ECM沉積，起到抗肺纖維化的作用。

彭清等[43]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液腹腔注射干預(yù)肺纖維化大鼠后，大鼠肺組織中MMP-2 mRNA、TIMP-1 mRNA表達(dá)水平均降低，MMP-2/TIMP-1比值趨于平衡，肺纖維化進(jìn)程被抑制。黃芪注射液可明顯下調(diào)肺纖維化患者血清中MMP-9，顯著提高療效[44]。但該實(shí)驗(yàn)存在明顯缺陷，其未觀察TIMP-1指標(biāo)變化，未探尋黃芪注射液通過調(diào)控MMP-9/TIMP-1之間的比例平衡干預(yù)肺纖維化的作用機(jī)制?？麓哄\等[45]實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪提取物可抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中的MMP-9、TIMP-1，調(diào)控兩者之間比例，延緩肺纖維化發(fā)展。

5 抑制肺部血管新生

肺臟血管異常增生是PF的重要發(fā)病機(jī)制之一。研究顯示，肺纖維化中許多血管新生相關(guān)細(xì)胞因子異常升高，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BFGF）等[46-47]，肺部血管增生明顯，微血管密度升高。欒智華等[48]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低肺纖維化小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2）mRNA表達(dá)，抑制肺部血管生成，減輕肺纖維化程度。還有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能明顯抑制肺纖維化大鼠BFGF表達(dá)，抑制微血管增生從而降低MVD，達(dá)到抗肺纖維化作用，其作用效果具有劑量依賴性[49]。另外，黃芪水提物也可降低VEGF及其基因的表達(dá)，改善肺纖維化程度[50]。

6 小 結(jié)

肺纖維化臨床致死率不亞于腫瘤，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，但目前尚無理想的治療藥物，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，錯(cuò)綜復(fù)雜[51]。因此，尋找更加有效的治療靶點(diǎn)及藥物的研發(fā)是當(dāng)下的首要方向。目前針對(duì)黃芪治療PF發(fā)病機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬被抑制、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)金屬蛋白酶系失衡、新生血管過度等因素。各因素之間存在關(guān)聯(lián)制約關(guān)系，激活自噬可降低氧化應(yīng)激水平從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，維持MMPs/TIMPs動(dòng)態(tài)平衡，減輕肺纖維化[27，52-53]；另外，多種效應(yīng)中涉及多條相同信號(hào)通路、細(xì)胞因子，但多數(shù)關(guān)于黃芪治療肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究只針對(duì)單一細(xì)胞因子或信號(hào)通路，缺乏多種作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)串聯(lián)關(guān)系的系統(tǒng)研究。有些單一信號(hào)通路研究尚不完整，缺乏精確性，如黃芪甲苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)肺組織細(xì)胞自噬活性，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，延緩肺纖維化進(jìn)程；黃芪甲苷還可降低肺纖維化小鼠VEGF、VEGFR-2、BFGF表達(dá)，抑制肺部血管生成，減輕肺纖維化程度。有研究證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路是血管新生的調(diào)控中心[54]，同時(shí)還能上調(diào)MMPs表達(dá)水平，間接促進(jìn)EMT[55]。但黃芪甲苷抑制血管新生、抑制EMT是否也與此信號(hào)通路有關(guān)尚無實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

研究界對(duì)黃芪治療肺纖維化機(jī)制做了大量研究，取得了可觀的實(shí)驗(yàn)成果，且已有黃芪類藥物制劑應(yīng)用于臨床治療肺纖維化，但其具體作用機(jī)制及治療靶標(biāo)仍有待進(jìn)一步精確完善，為臨床用藥及新型藥物的研發(fā)提供新思路。